Limagrain Bio-Santé, division qui regroupe les activités thérapeutiques du groupe Limagrain, vient d'inaugurer son nouveau laboratoire dans la zone du Brézet, à Clermont-Ferrand. Cette unité a pour vocation d'extraire et de purifier des protéines à usage thérapeutique produites par tabac et maïs.
CLERMONT-FERRAND. Le laboratoire inauguré, vendredi dernier, dans la zone du Brézet, à Clermont-Ferrand, représente actuellement une première, en partenariat avec l'industrie pharmaceutique, pour la production d'une protéine destinée à lutter contre la mucoviscidose.
Son directeur, Bertrand Merot, a souligné - qu'il s'agissait là du premier pilote au monde destiné à purifier des protéines produites par biotechnologie dans le tabac et le mais et destinées à lutter contre des maladies génétiques ou à la production de vaccins.
Pierre Pagesse, président de Limagrain, et Alain Catala, directeur général, ont souligné l'importance que revêt cette implantation dans la- stratégie de développement du groupe Limagrain et dans le développement économique de la région.
En effet, Limagrain investit, chaque année, plus de 300 millions de francs dans la recherche sur l'amélioration des plantes. .
Aujourd'hui, le formidable essor de cet outil scientifique qu'est le génie génétique ouvre au sélectionneur des perspectives fantastiques, grâce noLimagrain, pour sa part, y travaille maintenant depuis plus de dix ans. Il est certain qu'à relativement court terme les conséquences de ces progrès permettront à l'agriculture : de répondre aux problèmes posés par un accroissement important de la population mondiale au niveau de l'alimentation, grâce à une amélioration de la productivité par une meilleure résistance des plantes aux insectes, champignons, virus et herbicides et à une extension possible des surfaces cultivables aujourd'hui limitées, grâce à des cultures de plantes moins exigeantes en eau et résistantes à la salinité; ils favoriseront aussi l'orientation des cultures vers les besoins spécifiques des utilisateurs, que ce soient les industriels ou les consommateurs.
En se rapprochant des besoins finaux, les nouvelles variétés de plantes amèneront une simplification importante des procédés de fabrication industrielle.
Enfin, 1'utilisation,des plantes comme de véritables usines à molécules permettent d'offrir une alternative aux industriels de la santé, grâce à la production de substances thérapeutiques naturelles indemnes de contamination virale.
La présence de ce laboratoire, d'après les responsables de Limagrain, peut " faire référence et servir de point d'attraction pour d'attirés scientifiques et industriels.
Limagrain Bio-Santé entre en phase de développement sur plusieurs programmes de recherche. Ces développements se feront en liaison avec l'industrie pharmaceutique et devraient ainsi apporter une contribution significative à la création d'un pôle santé performant en Auvergne ont-ils estimé.
HYBRIDATION MOLÉCULAIRE
1 - DÉFINITION
Quand un ADN bicatenaire est chauffé à une température supérieure à la température dite de fusion (Tm) les deux brins complémentaires se séparent par suite de la rupture des liaisons hydrogènes qui les maintiennent appariés. Si la température est abaissée brusquement, l'ADN restera sous forme simple brin. Si, en revanche, l'ADN est refroidi lentement, une réassociation des brins se fera progressivement. Cette réassociation correspond à l'hybridation , elle est la base de la plupart des manipulations en biologie moléculaire et son importance est due à la parfaite spécificité du réappariement ; c'est en effet ce phénomène d'hybridation entre deux séquences complémentaires qui permet la reconnaissance spécifique d'une séquence par une sonde.
II- FACTEURS INFLUENÇANT L'HYBRIDATION
De nombreux facteurs interviennent, permettant de modifier les conditions d'hybridation, et de faciliter les analyses qualitatives et quantitatives.
II-1 - LA CONCENTRATION EN ADN ET LE TEMPS
La réassociation de deux brins complémentaires implique que ces brins se retrouvent face à face. Ce phénomène aléatoire est favorisé par la concentration en ADN et par le temps de contact entre les deux séquences complémentaires.
On définit donc une variable qui résulte du produit de la concentration par le temps: le Cot. Quand l'hybridation a lieu entre ADN et ARN ce facteur porte le nom de Rot.
II-2 - TEMPÉRATURE
La vitesse de réassociation de deux brins est fonction de la température du milieu. Cette vitesse sera maximale pour une température d'environ 25% inférieure à la valeur du Tm.
11-3 - LA COMPLEXITÉ DES SÉQUENCES
Si la séquence qui doit être repérée est isolée parmi un grand nombre d'autres séquences, le temps de réappariement sera plus long.
11-4 - LA FORCE IONIQUE
L'hybridation nécessite une force ionique suffisante, généralement apportée par du NaCl à une concentration qui peut aller jusqu'à l M.
III - DIFFERENTS TYPES D'HYBRIDATION
III-1 - HYBRIDATION EN PHASE LIQUIDE
Dans ce cas les séquences que l'on désire hybrider sont en solution dans un tampon. Pour que ces séquences se rencontrent, il faut qu'il se crée dans le milieu une agitation moléculaire suffisante qui est fonction de la température ; dans la majorité des cas la température idéale d'hybridation se situe à 15 ' en dessous du Tm.
III-2 - HYBRIDATION SUR SUPPORT SOLIDE
Une des séquences complémentaires, la cible le plus souvent, est immobilisée sur un support solide. La séquence complémentaire, représentant tout ou partie d'un gène (la sonde) est apportée sous forme liquide, dans un tampon favorisant l'hybridation.
L'avantage de cette technique est sa plus grande maniabilité, la possibilité de répéter les hybridations avec des sondes différentes, et de séparer les fractions hybridées et non hybridées.
En revanche, les vitesses d'hybridation sont plus faibles, car une partie de l'ADN fixée n'est pas accessible à l'hybridation.
L'hybridation sur support solide est favorisée par différents facteurs qui seront apportés par le tampon contenant la sonde :
- une force ionique suffisante,
- la formamide : ce composé diminue la température de fusion et permet des hybridations à une température plus basse se situant habituellement à 42°C. La concentration de fornamide utilisée est de 50%,
- le sulfate de dextran : la présence de ce composé de haut poids moléculaire, favorise la réassociation des brins complémentaires. Il est utilisé habituellement à une concentration de 5 à 10%.
III-2.1 - Nature des supports solides
Les séquences cibles d'acide nucléique sont fixées sur deux types principaux de support solide
- Les membranes de nitrocellulose. Ces membranes ont été les premières employées, elles sont très fragiles, et les possibilités de déshybridation et réhybridation sont très limitées. Le mécanisme physique de la liaison n'est pas connu. Un passage de la membrane à 80'C permet une fixation irréversible.
- Les membranes synthétiques. Ces membranes à base de nylon ont une trame très résistante et sont donc plus faciles à manipuler. Une fixation par liaison covalente des acides nucléiques peut être obtenue soit par chauffage à 80'C, soit par irradiation UV à 254 nm. Les membranes peuvent subir de nombreuses déshybridations et réhybridations.
III-2.2 - Application
III-2.2.1 - Application à l'analyse de l'ADN génomique : technique de Southern
L'hybridation sur support solide après transfert sur membrane est à la base des techniques de biologie moléculaire ; cette méthode décrite en 1975 par Southern permet en effet de repérer une séquence unique sur l'ensemble du génome. La manipulation se déroule en plusieurs temps:
1/ Coupure de l'ADN génomique par un enzyme de restriction.
2/ Séparation des quelques millions de fragments obtenus, en fonction de leur taille, par électrophorèse en gel d'agarose. Dénaturation de l'ADN par immersion du gel dans la soude.
3/ Transfert sur membrane. Généralement ce transfert est passif par diffusion sous l'action d'un courant liquide entraîné par capillarité : c'est la technique de Southern (Fig. 29 et 30). Il est quelquefois accéléré en utilisant des dispositifs sous vide.
4/ Fixation des fragments d'ADN sur la membrane.
5/ Hybridation par la sonde marquée, susceptible de reconnaître spécifiquement le gène ou le fragment de gène que l'on veut visualiser.
6/ Lavages pour éliminer l'excès de sonde et empêcher les appariements non homologues.
7/ Autoradiographie et révélation.
III-2.2.2 - Hybridation in situ
L'hybridation in situ permet de localiser une séquence donnée d'ADN au sein d'une cellule : les deux applications principales sont :
repérer dans un ensemble de fragments d'ADN clonés et intégrés dans des bactéries, le fragment complémentaire recherché (criblage de banques).
la localisation d'un gène sur des chromosomes en métaphase, ou la présence d'une séquence dans un noyau en interphase.
Classiquement la sonde était marquée à l'aide d'un isotope radioactif (le plus souvent du tritium 3 H). Cette sonde est hybridée aux chromosomes métaphasiques préalablement dénaturés sur les lames mêmes du microscope. Après élimination de l'excès de sonde, une émulsion radio-sensible est coulée sur les lames. Après plusieurs semaines, le résultat peut être observé directement au microscope et les signaux positifs apparaissent sous forme de rains déposés sur les chromosomes. Cette méthode est très sensible mais la petite taille de la cible explique la faiblesse du signal, que l'on ne peut visualiser sur toutes les mitoses l'observation d'un grand nombre de lames sera donc nécessaire.
Depuis le développement des marquages froids, l'hybridation in situ a connu des développements
importants. Dans ce cas, les sondes sont marquées par la biotine ou par un haptène tel que la digoxigénine et la révélation se fait soit par l'avidine soit par un anticorps anti-digoxigénine, ces révélateurs étant eux-mêmes couplés à une enzyme ou à un fluorochrome.
L'utilisation de la fluorescence a donné son nom à la technique FISH (fluorescence in situ hybridization). Cette technique représente une aide précieuse pour la cartographie physique car elle permet de localiser des sondes cosmidiques ou des YACs sur un chromosome. Sa résolution s'est encore améliorée avec la technique d'hybridation in situ sur les noyaux en interphase. Dans ce cas, l'ADN est étiré sur la lame du microscope et la résolution de la méthode peut atteindre 10 kb.