D.E.A. GENIE ENZYMATIQUE, BIOCONVERSION ET MICROBIOLOGIE

UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE

Laboratoire Androgenèse et Biotechnologies Faculté des Sciences33, rue Saint Leu 80039 AMIENS

Présenté par Alexandre VALLET le 12 SEPTEMBRE 1996.

Contribution à l’étude de la biosynthèse des alcaloïdes tropaniques chez le Datura innoxia Mill.; transformation par Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes et culture de chevelus racinaires.

 Remarque: cette pré-version est déporvue des illustrations, annexes et résultats exaustifs afin de pas alourdir le fichier. Des compléments seront ajoutés dans une version ultérieure. Bonne lecture!

Avant propos

Je dois beaucoup à Madame et Monsieur les Professeur B.S. et R.S. Sangwan ainsi qu’à Mme Michèle Boitel de m'avoir accueilli au sein du Laboratoire d'Androgenèse et Biotechnologie pour me permettre de réaliser ce stage de D.E.A.

Je remercie aussi tout particulièrement Philippe Joubert, Corinne Ducrocq, Jean Claude Laberche et Manuella Catterou pour leurs remarques pertinentes au sujet de ce manuscrit et leur aide tout au long de cette année.

Merci enfin à toutes les personnes travaillant au laboratoire pour leur entrain, leurs conseils et qui m'ont permis d'effectuer ce travail dans d’excellentes conditions, aux amis qui m'ont accompagné tout au long de cette année et ont répondu à de nombreuses questions au sujet de mon stage.

TABLE DES MATIÈRES

Introduction
Synthèse bibliographique
I. Le Datura innoxia Mill.
II. La chaîne de biosynthèse de l'hyoscyamine et de la scopolamine
III. Localisation histologique des alcaloïdes
IV. Transformation de Datura innoxia Mill. par Agrobacterium tumefaciens
IV.1. Principe de la transformation
IV.2. Les plantes transformées
V. Transformation de Datura innoxia Mill. par Agrobacterium rhizogenes
V.1. Principe de la transformation
V.2. Intérêt des chevelus racinaires
V.3. Les racines néoformées
VI. Extraction et Dosage des alcaloïdes
VI.1. La Chromatographie Liquide Haute Performance (H.P.L.C.)
VI.2. La chromatographie sur couche mince (C.C.M.)
Présentation des objectifs
Matériel et méthodes
I · Le matériel végétal
I.1 Obtention de chevelus racinaires
I.2 Les plantes doublement transformées cultivées en serre
I.3 Obtention de la première génération issue des jeunes plantes transformées
II · Extraction-dosage des alcaloïdes
II.1 Analyses par H.P.L.C.
II.2 Technique de dosage sur C.C.M.
Résultats et discussion
I. Initiation et entretien du matériel végétal
I.1 Première génération de plantes transformées par le gène P5CR
I.2 Initiation et entretien des vitroplants transformés par P5CR
I.3 Obtention des clones racinaires
I.4 Entretien de clones racinaires
II. Analyse du contenu alcaloïdique
II.1 Amélioration de la technique de dosage par H.P.L.C.
II.2 Mise au point d’une technique d’analyse rapide en C.C.M.
II.3 Analyse des clones racinaires
II.4 Analyse des plantes transgéniques P5CR
Conclusion et perspectives
Bibliographie
Annexes NON ENCORE DISPONIBLES
Planches photographiques NON ENCORE DISPONIBLES

Introduction

A côté du métabolisme primaire vital, il existe un métabolisme dit secondaire, non vital et dont dérivent de nombreux composés, dont le groupe des alcaloïdes. On désigne sous ce nom des composés azotés complexes, rencontrés surtout chez les végétaux, et doués de propriétés physiologiques et toxicologiques remarquables [Moreau 1964]. Les alcaloïdes ont un caractère basique marqué, comportant une ou plusieurs fonctions amines, et sont le plus souvent très toxiques à l'état pur (héroïne, mescaline, nicotine, caféine, etc.), mais ils peuvent aussi apporter d'intéressantes applications pharmaceutiques.

Les tissus sont, chez quelques végétaux, naturellement très riches en alcaloïdes: les écorces sèches des Quinquinas jaunes contiennent plus de 10 p. 100 d'alcaloïdes totaux et celles de l'Iloba 5 p. 100, les feuilles de différents Buis et de Funtumia également 5 p. 100 [Janot 1986]. D'une manière générale, on ne peut attribuer à un tissu particulier l'exclusivité de produire des alcaloïdes: ceux-ci proviennent, tantôt des racines ou des graines, comme chez les Solanacées, tantôt des feuilles , comme chez les Quinquinas (Rubiacées) [Janot 1986]. Cependant, même en cultivant artificiellement les organes les plus producteurs d'alcaloïdes, leurs teneurs et taux d'excrétion naturels restent trop faibles pour se prêter à une exploitation industrielle rentable. Or, avec l'arrivée des biotechnologies, il est aujourd'hui possible de chercher à accroître de manière plus sélective et efficace la production d'alcaloïdes. Datura innoxia Mill. est une Solanacée dont les principaux métabolites secondaires actifs sont l'hyoscyamine et la scopolamine. Synthétisés essentiellement au niveau des racines [Plank 1985], ces composés possèdent des propriétés pharmaceutiques intéressantes [He Li-Yi 1989, Timothy 1995], c'est pourquoi on cherche à cultiver cet organe in vitro, puis à terme en fermenteur, afin de lui faire produire de grandes quantités de scopolamine et d'hyoscyamine [Payne 1987, Van de Velde 1988, Ducrocq 1994].

Or, bien que de nombreuses approches et techniques aient tenté d'optimiser la synthèse de scopolamine et d'hyoscyamine, la capacité de synthèse d'alcaloïdes de chevelus racinaires issus d’une double transformation génétique a été, quant à elle, peu étudiée.

Cette étude fait suite au travail de D.E.A. de Françoise Debierre-Grockiego, qui, en 1995, tentait d'obtenir des chevelus racinaires doublement transformés de Datura innoxia Mill. . En effet, on cherche par ce biais à augmenter principalement la synthèse de deux composés: l'hyoscyamine et la scopolamine. La voie suivie consiste à faire subir, à des explants foliaires de plantes témoin, une première transformation par Agrobacterium tumefaciens, visant à incorporer le gène P5CR, codant pour une enzyme, la D1-Pyrroline-5-Carboxylate Réductase. Celle-ci catalyse la biosynthèse de proline, qui pourrait en effet intervenir dans la synthèse des alcaloïdes tropaniques auxquels appartiennent l'hyoscyamine et la scopolamine. Une seconde transformation des plantes transgéniques ainsi régénérées par Agrobacterium rhizogenes permet le développement de racines doublement transgéniques. Après l'apparition de telles racines adventives, le choix judicieux de milieux de culture solide, puis liquide, permet leur croissance et leur entretien sous forme de chevelus.

L'objectif de ce D.E.A. est de quantifier statistiquement l’influence de la double transformation chez les différents clones de Datura innoxia, au niveau de la synthèse de l'hyoscyamine et de la scopolamine.

Pour parvenir à cette fin, il est nécessaire de travailler dans un premier temps sur un grand nombre de jeunes plantes transformées par P5CR, d’induire la formation de chevelus racinaires puis de déterminer le contenu alcaloïdique de ces derniers par une méthode fiable, efficace et rapide.

Précise mais longue, la technique de dosage par H.P.L.C. est inadaptée au nombre d’échantillons que nous avons à analyser.

Un aspect du travail consiste par conséquent à développer une technique de dosage par Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M.), soit-elle moins précise. Elle a pour objectif de permettre d’analyser rapidement un grand nombre d’échantillons, afin d’en effectuer une pré-sélection.

Synthèse bibliographique

I. Le Datura innoxia Mill.:

Le Datura innoxia, originaire du Mexique, appartient à la famille des Solanacées (Planche 1). Cette plante qui a été largement étudiée in vitro [Petri et al. 1989], est une source intéressante de métabolites secondaires, et peut être régénérée à partir de presque tous ses organes [Ducrocq 1994]. La majorité de ces derniers produisent des alcaloïdes tropaniques [Desailly et al. 1988] dont les principaux, l'hyoscyamine et la scopolamine [Petri et al. 1989], (voir Figure 1) ont des propriétés neurosédatives et antispasmodiques [He li-yi et al. 1989, Timothy et al. 1995]. Le rôle des métabolites secondaires dans la plante est encore indéterminé. Ils ne sont pas vitaux mais interviennent dans la modulation du comportement de la plante par rapport à son environnement (résistance aux stress, défense contre prédateurs) (Janot M. M. 1986].

Figure 1: Deux métabolites secondaires du Datura innoxia.

II. La chaîne de biosynthèse de l'hyoscyamine et de la scopolamine:

L'hyoscyamine et la scopolamine sont issus du cycle des polyamines [Heby 1981, Hougaard 1992]. Les deux précurseurs de la chaîne de biosynthèse sont l'Ornithine et l'Arginine. Les deux activités enzymatiques initiales sont l'Ornithine décarboxylase (ODC) et l'Arginine décarboxylase (ADC) [Verzar-Petri 1971]. La voie de biosynthèse de la scopolamine est complexe et fait intervenir plusieurs précurseurs différents, comme le rapporte en 1995 Debierre-Grokiego, mais cet alcaloïde est directement issu de l'hyoscyamine par époxydation [Timothy 1995] comme indiqué sur la Figure 2. Ce phénomène met en jeu deux enzymes: l'hyoscyamine 6-b-hydroxylase [Hashimoto et al. 1986], localisée au niveau du péricycle des jeunes racines [Hashimoto et al., 1991], et l'hyoscyamine 6-b-époxydase [Hashimoto et al. 1987] principalement localisée dans les feuilles.

Figure 2: Chaîne de biosynthèse de la scopolamine chez les racines de D. innoxia [Robins et al. 1990].

Certains travaux indiquent des étapes sensibles à la rétroinhibition [Robins et al. 1990], telles que l'arginine décarboxylase par son produit direct, l’agmatine, ainsi que par d'autres plus distants comme la putrescine ou l'atropine. Selon ces mêmes auteurs, l'ajout de produits intermédiaires chez D. stramonium (putrescine, agmatine ou tropine) n'augmenterait pas l'accumulation de métabolites, voire diminuerait la concentration d'hyoscyamine. Cependant la principale étape limitante serait l'estérification de la tropine.

En vue de chercher à accroître la production alcaloïdique en s’affranchissant de ces limites, les plantes ont été transformées par le gène P5CR (pour D1-Pyrroline-5-Carboxylate Réductase), qui code pour une enzyme de synthèse de la proline [Delaunay et Verma 1990, Ducrocq 1994] (Figure 2).

III. Localisation histologique des alcaloïdes:

Les alcaloïdes se retrouvent au niveau des poils glandulaires de l'épiderme et des poils racinaires du rhizoderme ce qui indiquerait une sorte de mécanisme d'excrétion [Plank et al. 1985]. Ils sont d'ailleurs excrétés dans le phloème intercellulaire et le parenchyme médullaire ou ils cristallisent dans des cellules précises: les idioblastes. L'hyoscyamine est synthétisée dans les racines [Plank et al. 1985; Petri et al. 1989, Martin 1995, Romeike 1959, 1961] et transportée par le xylème jusqu'aux feuilles. Elle peut, à ce niveau, être redistribuée par le phloème de façon acropète et basipète, tandis que sa conversion en scopolamine par époxydation a essentiellement lieu dans le mésophylle photosynthétique des feuilles (très peu dans les racines).

Les répartitions des alcaloïdes au niveau d'une plante, comme on peut l’imaginer chez le Datura innoxia, sont indiquées sur la Figure 3 selon Desailly et al. en 1988 pour le Datura stramonium. Remarquons que la teneur en alcaloïdes varie également au sein d'un même organe, selon les organites cellulaires; les chloroplastes semblent en effet impliqués dans la transformation de l'hyoscyamine en scopolamine [Fliniaux 1987].

IV. Transformation de Datura innoxia Mill. par Agrobacterium tumefaciens:

Depuis la découverte d’Agrobacterium tumefaciens par Smith et Towsend en 1907 et de sa propriété naturelle à engendrer la maladie de la galle du collet, par transfert et expression d’un fragment d’ADN, le t-DNA, aux cellules végétales, des applications biotechnologiques ont été développées à partir de cette bactérie.

L’emploi d’une souche d'A. tumefaciens dont le t-DNA a été remplacé par le gène P5CR, a permis de transférer ce dernier à des explants foliaires de Datura innoxia Mill,. tel que l'a décrit Ducrocq en 1995. Les plantes régénérées à partir des explants foliaires ainsi transformés, sont susceptibles de présenter des facultés de synthèse d’alcaloïdes tropaniques accrues.

IV.1. Principe de la transformation:

Agrobacterium tumefaciens est naturellement responsable d'une affection essentiellement dirigée envers les dicotylédones: la galle du collet [Smith et Townsend 1907]. L'effet de virulence est porté par un plasmide bactérien appelé Ti (Tumor-inducing) [Zaenen 1974]. Les mécanismes moléculaires sous-tendant cette affection résultent du transfert au site d'infection d'une portion du plasmide: le t-DNA. Celui-ci peut être transféré en un ou deux fragments d'ADN à un site d'intégration intracellulaire de la plante hôte, où il s'exprime. Pour réaliser une transformation par un gène d'intérêt, seul le pouvoir infectieux du t-DNA est conservé (c’est à dire sa faculté de s’insérer au génôme végétal), tandis que la partie responsable de son pouvoir tumorigène (constituée de gènes de synthèse d’hormones) est remplacée par le gène d'intérêt. Le t-DNA code, entre autre pour des Opines [Clare 1990] qui servent de source énergétique pour les bactéries et qui créent un environnement favorable à la croissance et à la propagation de l'agent pathogène [Petit et al. 1983]. Spencer et Towers en 1988 démontrèrent que les Agrobactéries sont attirées par l'hôte via un gradient de composés phénoliques (tel que l'acétosyringone), excrétés par des cellules végétales blessées. La Figure 4 illustre les mécanismes mis en jeu lors de l'infection d'un végétal par une souche modifiée « P5CR » d’Agrobacterium tumefaciens.

Figure 3: Teneur en alcaloïdes tropaniques de divers organes de Datura stramonium L. [Desailly et al. 1988], exprimée en % moyen du poids sec.

Figure 4: Mécanismes transformationnels mis en jeu chez une souche modifiée « P5CR » d’Agrobacterium tumefaciens, lors de l’infection du Datura innoxia Mill.

IV.2. Les plantes transformées:

Après transformation, il convient de régénérer les explants transformés. Les milieux les plus adéquats pour développer de manière indirecte des bourgeons à partir de disques foliaires sont caractérisées par un rapport A.N.A./B.A.P. [Ducrocq C. 1995]. La transformation avec le gène d'intérêt P5CR semble induire des variations alcaloïdiques entre clones, mais peu de différences entre les témoins en serre et les témoins in vitro. Par ailleurs, les teneurs en proline semblent se corrèler aux teneurs en alcaloïdes (Ducrocq C. 1995). Un autre facteur, la variation de ploïdie, est susceptible de modifier la qualité d'une transformation [Yamada et al. 1986] et ainsi, influer sur les teneurs alcaloïdiques. Les plantes transgéniques sont sélectionnées par leur résistance à la kanamycine, le gène NPTII ayant été intégré avec le gène d’intérêt. La présence de ce dernier ainsi que de NPTII, peut être contrôlée par test de Southern ou P.C.R. [Ducrocq 1994].

V. Transformation de Datura innoxia Mill. par Agrobacterium rhizogenes:

Chez A. rhizogenes, les gènes plasmidiques rol sont responsables du pouvoir transformant, qui se traduit par un développement anormal de racines, susceptibles d'être cultivées ultérieurement en chevelu racinaire [Christen et al. 1993]. La transformation par A. rhizogenes peut s'effectuer après une première transformation par A. tumefaciens, en vue d'accroître encore la production d'alcaloïdes tropaniques [Ducrocq 1994, Debierre-Grockiego 1995].

V.1. Principe de la transformation:

Agrobacterium rhizogenes induit la formation de racines adventives sur les tissus infecté de Dicotylédones [Christen et al. 1993]. De même que pour Agrobacterium tumefaciens, le mécanisme implique le transfert d'une portion du plasmide appelé cette fois Ri (pour Root inducing) vers le génome de la plante hôte (Figure 5). Les racines ainsi induites peuvent se développer in vitro en absence de régulateurs de croissance exogènes [Debierre-Grockiego 1995], grace à des gènes de synthèse d'hormones, transférés depuis le plasmide Ri (voir plus loin). L'apparition et le phénotype des racines peut être variable selon la souche bactérienne employée (Tableau 1), avec ou sans ramifications latérales chez le Datura candida par [Giuletti et al. en 1993].

Tableau 1: Influence des souches bactériennes sur l'aspect des racines d'Hyoscyamus muticus. D'après Vanhala et al. 1994.

variété d'Agrobactérie phénotype racinaire

A4 blanches, fines, longues

C58 brunes, fines, courtes, se ramifient et forment des cals

LBA9402 fines, blanches, verdissent à la lumière

15834 vertes, longues, bactéries difficiles à éliminer

Ce sont trois gènes agissant de concert qui sont responsables de l'apparition des racines et de leur phénotype: les gènes rol A, rol B, rol C [Gaudin et al. 1994]. L'expression du gène rol A est tissu-dépendante [Guivarc'h et al. 1996], quant au gène rol B, il augmente quant à lui la sensibilité des cellules envers les auxines, tout en codant pour une b-glucosidase, qui accroîtrait le taux d'auxines actives. Rol C code pour une cytokinine b-glucosidase, qui catalyse la formation de cytokinines actives et stimule la croissance des racines.

Pour induire l'apparition des racines transformées, la transformation par Agrobacterium rhizogenes en suivant le protocole de piqûre donne de bons résultats. Les jeunes plantes sont piquées à l'aide d'une aiguille après avoir prélevé par son extrémité une souche bactérienne, comme indiqué par Debierre-Grockiego et Ducrocq en 1995 (Figure 6).

Figure 5: Mécanismes mis en jeu lors de l'infection d'un végétal par Agrobacterium rhizogenes.

Figure 6: Principe d'obtention de chevelus racinaires à partir d'une jeune plante transgénique (double transformation).

V.2. Intérêt des chevelus racinaires:

La synthèse chimique des alcaloïdes tropaniques est plus coûteuse que leur extraction de leur source naturelle [Christen et al. 1993]. Les alcaloïdes tropaniques sont synthétisés principalement au niveau des racines [Plank et al. 1986; Martin 1995]. C'est pourquoi on cherche à transformer efficacement et à cultiver cet organe in vitro, puis à terme en fermenteur, afin de lui faire produire une plus grande quantité de scopolamine et d'hyoscyamine [Payne et al. 1987, Van de Velde 1988, Ducrocq 1994; Boitel et al. 1995, 1996]. Initialement, les suspensions de cellules étaient cultivées en fermenteurs, mais celles-ci, contrairement aux chevelus racinaires, ne synthétisent pas de taux stables et élevés d'alcaloïdes [Christen et al. 1993, Gontier E. 1993 et Gontier E. et al. 1994]; elles perdent le potentiel des voies métaboliques caractéristiques des plantes entières.

Les racines quant à elles, sont aisément cultivables sous forme de chevelus après transformation par Agrobacterium rhizogenes, qui en induit la formation [Christen et al. 1993]. Le Tableau 2 indique les teneurs en alcaloïdes de chevelus racinaires établis sur six espèces de Datura. L'utilisation d'un détergent, le tween-20, accroît en outre les métabolites secondaires retrouvés dans le milieu de culture [Boitel et al. 1995].

Pour augmenter le niveau de production d'alcaloïdes, il est de surcroît possible de travailler sur les hybrides [Robins et al., 1990]. L'hybride de D.candida et aurea obtenu par Robins et al. en 1990 ou encore D.stramonium x D.discolor [Christen 1993] transformés par Agrobacterium rhizogenes sont hautement compétents pour synthétiser des alcaloïdes tels que scopolamine et hyoscyamine. Selon Debierre-Grokiego (1995), la double transformation (par Agrobacterium tumefaciens modifié "P5CR" et Agrobacterium rhizogenes) peut engendrer des chevelus racinaires encore plus producteurs d'alcaloïdes tropaniques.

Tableau 2: Teneurs en alcaloïdes de chevelus racinaires établis sur six espèces de Datura. D’après Christen et al. 1993

Datura sp.	Scopolamine mg/100 g M.S.	Hyoscyamine mg/100 g M.S.
D. innoxia	486	110
D. quercifolia	419	trace
D. stramonium	1053	0
D. ferox	849	43
D. fastuosa	561	9
D. wrightii	820	15

V.3. Les racines néoformées:

Les racines néoformées apparaissent au site d'inoculation d'Agrobacterium rhizogenes. Leur caractère transgénique est reconnaissable par la présence de gènes de sélection et marqueurs, tels que NPTII et G.U.S. , respectivement introduits par A. tumefaciens, A. rhizogenes A4Km (NPTII + G.U.S.).

Le Tableau 3 montre l’influence de quatre souches bactériennes, de la nature du milieu de culture, sur le développement de racines néoformées.

Tableau 3: Effet du milieu, de la souche bactérienne et de la durée d'infection sur l'apparition de racines chez Hyoscyamus muticus. D'après Vanhala et al. 1994.

Souche bactérienne Milieu de culture Nombre de racines apparues après 48 h d’infection

LBA9402 LS0B50 187

C58 LS0B50 >301

A4 LS0B50 00

15834 LS0B50 31

Milieu LS0: milieu de Linsmaier et Skoog (1965) sans régulateurs de croissance.

Milieu B50: milieu de Gamborg (1968) sans régulateurs de croissance.

L'obtention de chevelus racinaires à partir de racines induites par Agrobacterium rhizogenes, passe généralement par la culture de ces dernières sur un premier milieu solide, puis dans des volumes croissants de milieu liquide. La nature des milieux utilisés varie selon les auteurs, mais ils peuvent être un critère de réussite dans la culture des chevelus racinaires. Le tableau 4 résume l'ensemble des milieux de culture racinaires utilisés par les différents auteurs.

Les racines néoformées peuvent être directement transférées dans 20 ml de milieu L.S. (Annexe 1) liquide [Deno et al. 1987] sans régulateurs de croissance, additionné de 0,1 g/l d'ampicilline, ou encore avec 100 mg/l de céfotaxime [Knopp et al., 1988], en vue d'éradiquer les Agrobactéries devenues inutiles. Cultivées à l'obscurité à 25°C, elles sont, après développement, transvasées dans un volume de 100 ml de milieu L.S. liquide. Selon les auteurs l'ajout d'hormones n'accroitrait ou ne diminuerait pas les taux d'alcaloïdes.

[Christen et al. 1992] cultivent pour leur part les racines néoformées sur milieu M.S. solide additionné de 500 mg/l de céfotaxime. La culture se poursuit à 25°C à la lumière en milieu B5 liquide à raison de 50 ml par flacon, avec 3% de saccharose et agité à 100 rpm (ou encore 90 rpm pour [Corry et al. 1993], avec 0,2 g de matière sèche par flacon). Parmi les milieux essayés, à savoir M.S./2, M.S., W.P. et B5, c'est ce dernier qui se révèle être le plus adéquat pour la production des alcaloïdes [Maldonado-Mendoza et al. 1992, Ducrocq 1994, Payne et al. 1987]. Dans ce milieu, Le KNO3 serait un élément essentiel dans l'induction des alcaloïdes tropaniques, suivi par le Cu2+. Cependant, c'est sur le milieu W.P. que la croissance des racines est la plus rapide [Christen et al. 1992].

En 1993, Christen et al. cultivent les racines sur milieu M.S. solide (1% d'agar), avec 3% de saccharose et 500 mg/l d'ampicilline, puis sans antibiotique, et enfin en milieu M.S. liquide. Selon les auteurs, certains régulateurs de croissance, dont l'acide gibbérellique GA3, agissent sur la croissance des chevelus racinaires de Datura innoxia. Des valeurs comprises entre 10 ng/l et 1 mg/l stimulent l'accroissement de la masse fraîche, ainsi que l'élongation et les ramifications des chevelus racinaires. L'influence d'un autre régulateur de croissance: l'A.I.B. (Acide Indole Butyrique) a été étudiée par Ermayanti et al. (1993), sur cultures de racines (non les chevelus racinaires) de Swainsona galegifolia (Andr.) R. Br de 1 cm de long en milieu MS liquide sans hormones. Même de faibles doses d'AIB (0,2 mg/l) s'avèrent mortelles pour les racines en culture. L'auteur témoigne, par ailleurs, de larges variations de ploïdie chez les racines transformées et cultivées sans A.I.B.

Enfin, Debierre-Grockiego (1995) cultive les chevelus racinaires induits par Agrobacterium rhizogenes A4Km sur milieu MSB avec 500 mg/l de Carbénicilline et 500 mg/l de Céfotaxime, puis en milieu B5. Un grand nombre de racines, initiées en milieu solide, s'avèrent incultivables en milieu liquide.

Tableau 1: Exemples de milieux de culture racinaires utilisés par différents auteurs, en vue de cultiver des chevelus racinaires.

Auteurs Espèce Milieu solide Milieu liquide Régulateurs de croissance
Knopp et al. 1988 Solanaceae dont Datura innoxia Mill. L.S. + céfotaxime 100 ppm non	Christen et al. 1992 Hyoscyamus albus M.S. + céfotaxime 500 mg/l milieux B5, M.S., M.S./2, W.P. + 3% saccharose non
Christen et al. 1993 Datura sp. M.S. + 3% saccharose + 1% d'agar + 500 mg/l ampicilline puis sans amp. M.S. GA3 facultative-ment de 10 ng/l à 1 mg/l.	Debierre-Grockiego 1995 Datura innoxia Mill. M.S. + 8 g/l d'agar, 20 g/l de saccharose, carbénicilline + céfotaxime 500 mg/l B5 + céfotaxime 500 mg/l non
M.S.: Murashige et Skoog 1962; B5: Gamborg 1968; W.P.: Lloyd et Mc. Cown 1980, L.S.: Linsmaier et al. 1965.	Deno et al. 1987 Duboisia myoporoïdes L.S. + ampicilline 100 ppm non

La synthèse de métabolites chez Datura innoxia transformé par A.r. A4 ou A4Km est stable et durable [Ducrocq 1994]. On en retrouve environ 2 fois plus que dans des racines normales selon Maldonado et al. (1992), Debierre-Grockiego (1995). La synthèse chez Hyoscyamus albus -après transformation par la souche (la plus efficace) Agrobacterium rhizogenes MAFF003-01724 à la lumière- est accrue [Sauwerwein 1991] et stable [Payne et al. 1987].

VI. Extraction et Dosage des alcaloïdes:

Etant donné qu'il semble exister un gradient métabolique dans la répartition des alcaloïdes dans les plantes [Cougoul et al. 1978; Desailly et al. 1988], il convient d’effectuer les mesures sur des prélèvements standards. Ducrocq C. (1995) prélève la quatrième feuille. Les alcaloïdes tropaniques peuvent être séparés et dosés selon différentes techniques: E.L.I.S.A. , C.C.M., H.P.L.C., C.P.G ; la plus performante semblant être la C.P.G. (Witte et al. 1987, Robins et al. 1990).

L'extraction des alcaloïdes tropaniques peut s'effectuer sur le produit sec réduit en poudre [He li-yi et al. 1989]. Celui-ci est macéré dans une solution de chloroforme et d'ammonium pendant une nuit. Après filtration, la phase chloroformique est évaporée, reprise dans une solution de méthanol, phosphate de sodium et Sodium Dodécyl Sulfate. La plupart des auteurs effectuent leurs dosages sur de grandes quantités de matière sèche. [Flores et al. 1982] par exemple en utilisant 100 mg, extraits au chloroforme par partition de phase. Plus simplement, on peut extraire les alcaloïdes au méthanol sur fragments de feuilles selon Graham Crabbe et al. en 1980, mais on co-extrait selon ce procédé de grandes quantités d'impuretés qu'il convient de séparer avant analyse. L'extrait méthanolique dilué à 45% dans de l'eau est purifié sur colonne Waters Bondapak C18. Les alcaloïdes purifiés sont injectés dans la chaîne H.P.L.C. avec du méthanol pur. D'autres auteurs, ayant recours à des dosages immunoenzymatiques [Fliniaux et al. 1986], n'utilisent que 30, voire 10 mg de matière sèche par E.L.I.S.A., tel [Knopp et al. 1988: Desailly et al. 1988].

VI.1. La Chromatographie Liquide Haute Performance (H.P.L.C.):

Monforte-Gonzalez et al. 1992 portent leurs essais sur 0,5g de racines de D. stramonium, lyophilisées, correspondant à environ 1-8 µg d'alcaloïdes tropaniques, lesquels sont extraits 2 mn. au méthanol. La solution finale (pH 9,5) est injectée dans un mélange de méthanol, Me2Co, CHCl3 NH4OH.

La phase mobile utilisée par Mandal et al. en 1991 est constituée par un mélange d'eau, d'acétonitrile 150%0 et d'acide phosphorique, le pH est ajusté à 2,2.

Walter et al. (1997) pratiquent l'extraction des alcaloïdes sur 200-250 mg de tissus congelés.

Outre la reproductibilité et la précision nécessaires à toute démarche analytique, la rapidité est cependant imposée par le grand nombre d'analyses nécessaires pour sélectionner les clones les plus productifs parmi toute une collection. L'alternative aux dosages par H.P.L.C. (Figure 7) serait d'utiliser la Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M.). Cette technique permettrait d'effectuer une première évaluation, un "screening" primaire, sur plusieurs échantillons en parallèle, avec un protocole d'extraction plus léger. [Rozylo J.K. et al. 1994]. La chaîne H.P.L.C. serait ainsi libérée pour des dosages quantitatifs de précision, portant sur les seuls échantillons intéressants précédemment sélectionnés.

Figure 7: Principe du dosage des alcaloïdes tropaniques par H.P.L.C.

VI.2. La chromatographie sur couche mince (C.C.M.):

Cette technique utilise la propriété d'adsorption d'un gel de silice ou d'acétate de cellulose, coulé sur un support plastique, pour faire migrer une phase mobile et séparer les constituants qu'elle élue (Figure 8 et Figure 9). Les particules sont séparées selon un principe commun aux différents techniques de chromatographie: elles se répartissent dans le temps sur la phase stationnaire selon leurs affinités pour cette dernière qui tend à les retenir, et une phase mobile qui les entraîne.

S'adressant à un grand nombre d'échantillons, cette technique s'avère être l'alternative de choix aux dosages par H.P.L.C. [Duez et al. 1985].

Selon la nature des composés séparés par C.C.M, les spots pour être visualisés, doivent être révélés à l’aide de réactifs spécifiques [Wagner et al. 1995].

Figure 8: Principe du dosage par C.C.M.

Figure 9: Principe de C.C.M. à deux dimensions. D’après Janot M. M. (1986).

Présentation des objectifs

Que ce soit du taxol de l’If, de la vinblastine de la pervenche de Madagascar employés comme anticancéreux, à l’atropine utilisée en ophtalmologie, les métabolites secondaires végétaux sont largement sollicités par la médecine et l’industrie pharmaceutique. Les alcaloïdes représentent 90 % des métabolites secondaires [Dentin H.1996] et parmi ceux-ci, les alcaloïdes tropaniques, dont l’hyoscyamine, la scopolamine, présentent un intérêt certain.

Le Datura innoxia Mill., étudié au Laboratoire d'Androgenèse et Biotechnologies (A.E.B.), peut être considéré comme une plante modèle se cultivant et se régénérant facilement in vitro [Ducrocq C., 1995]. Couplée à une grande richesse en alcaloïdes tropaniques tels que l'hyoscyamine et la scopolamine, cette caractéristique s'avère fort intéressante lorsque l'on sait que les teneurs internes en ces deux composés sont trop faibles pour se prêter à une exploitation industrielle rentable. En vue d’accroître le contenu en hyoscyamine et scopolamine, une approche originale a été réalisée au laboratoire A.E.B., sur le mode d'une double transformation [Ducrocq C., 1995]. L'optique de cette démarche a été d'incorporer un gène pouvant être impliqué dans la biosynthèse des deux alcaloïdes précités: le gène P5CR et de cultiver les formes tissulaires riches du Datura innoxia, c'est à dire les chevelus racinaires, issus d'une seconde transformation génétique.

Au cours de mon stage, nous tâcherons de produire un grand nombre de ces chevelus racinaires à partir de quelques lignées initiales de plantes transgéniques. L'étude d'éventuelles variations alcaloïdiques nous renseignera sur l'efficacité de la double transformation génétique, et sur l'origine des éventuelles variations observées. Au laboratoire A.E.B., les alcaloïdes sont dosés par H.P.L.C. L'avantage d'un tel dosage est qu'il fournit des résultats précis en libérant le manipulateur durant son exécution, pendant 30 mn à 40 mn. Mais l'on ne peut doser qu'un échantillon pendant ce laps de temps, alors qu'une recherche de présélection ("screening" primaire) ne requiert pas de mesures de précision. De ce fait, les manipulations accumulent les échantillons plus vite qu'on ne peut en doser avec une seule chaîne H.P.L.C. L'alternative à cet obstacle est de mettre au point et d'utiliser une méthode plus rapide acceptant simultanément plusieurs échantillons, soit-elle moins précise.

Nous avons choisi pour cela la technique de chromatographie sur couche mince. Nous tacherons de développer un protocole permettant d'estimer rapidement un grand nombre d'échantillons, afin de faire ressortir les clones racinaires potentiellement intéressants, sur lesquels pourront porter des dosages par H.P.L.C.

Matériel et méthodes

I · Le matériel végétal transformé:

I.1 Obtention de chevelus racinaires:

Onze lignées, plantes et vitroplants transformés avec le gène P5CR par Ducrocq C. en 1995, sont disponibles au laboratoire. Ils sont issus de disques foliaires témoin initiaux, qui après transformation par coculture avec Agrobacterium tumefaciens (voir Figure 6), ont développé des cals puis des bourgeons. Chacun des bourgeons a engendré une jeune plante, cultivée in vitro. Sept lignées de ces plantes, répertoriées de A à G.2 ont été transférées en serre où elles sont cultivées (Planche 1). Quatre autres lignées numérotées de 1 à 4, se trouvent in vitro, sous une photopériode de 10 heures à 27 °C. La lignée 2 est multipliée en six boutures: 2; 2.1; 2.2; 2.3; 2.4; 2.5. Chacune des Onze lignées doit être multipliée de façon conforme in vitro avant de chercher à en obtenir des chevelus racinaires, afin que l'étude statistique puisse être établie sur un maximum d’événements. A cet effet, des fragments foliaires de chacune des plantes en serre sont remis en culture in vitro.

On peut envisager des différences observables entre chevelus racinaires issus de boutures d’un même clone initial (Figure 10). Des différences peuvent apparaître au niveau des plantes issues d’autofécondations, entre boutures in vitro et entre celles-ci et les vitroplants provenant des plantes cultivées en serre.

Figure 10: Exemple du procédé de multiplication des vitroplants par bouturage:

I.1.1 Régénération de jeunes plantes in vitro:

Selon les observations de Sangwan et al. en 1991 et de Ducrocq en 1995, les disques foliaires sont le matériel de choix pour obtenir de nombreux bourgeons. Ceux des plantes en serre viendront supplémenter la collection des quatre lignées déjà en culture. Les bourgeons et les jeunes plantes qu’ils auront permis d’initier présenteront théoriquement les mêmes caractéristiques physiologiques que la plante dont ils sont issus, variations somaclonales exceptées.

I.1.1.1 Désinfection du matériel foliaire transgénique:

Les feuilles sont prélevées à niveau identique sur les plantes cultivées en serre. Elles sont aussitôt désinfectées pendant dix minutes à l'hypochlorite de calcium à 7 %, puis à l'alcool durant quelques secondes. Les feuilles sont rincées à l'eau distillée stérile puis séchées sur papier filtre stérile.

I.1.1.2 Obtention de cals et de bourgeons:

Les limbes sont découpés en rectangles d'environ 1 cm de côté, puis placés sur un milieu de culture (MSB) (Planche 2) dont la composition est donnée en Annexe 1, en présence de kanamycine à 250 mg/l comme facteur de sélection des explants transformés. Le milieu peut être additionné en céfotaxime, qui est un antibiotique, pour pallier à un éventuel développement bactérien malgré la désinfection. Au bout de quelques jours, des cals apparaissent aux bordures des fragments de limbes. Les cals sont alors remis en culture sur le milieu MSB1 dont la teneur en BAP, diminuée de moitié, est adaptée à l'émergence et au développement des bourgeons.

I.1.3 Développement des jeunes plantes transgéniques:

L'élongation des bourgeons sur le milieu se poursuit jusqu'à ce qu'ils deviennent des jeunes pousses d'une hauteur de tige de quelques Millimètres. Elles sont alors en mesure d’être transférées pour cinq jours sur un troisième milieu (MSR, décrit en Annexe 2) en vue d'y initier leur appareil racinaire. L'évolution en jeunes plantes (Ducrocq 1994) se poursuit sur du milieu M.S..

I.1.2 Transformation des jeunes plantes par Agrobacterium rhizogenes et culture des racines néoformées:

Les jeunes plantes subissent l’action d'Agrobacterium rhizogenes lorsque leur tige a atteint un niveau de développement suffisant. Une piqûre à l’aide d’une aiguille assure la lésion des tissus et l’introduction de l’agrobactérie en leur sein, comme indiqué en Matériel & Méthodes V.1. « Principe de la transformation ». Dix à vingt-cinq jours plus tard, les racines apparaissent au site d’inoculation. Dans la négative, il se peut que les bactéries aient perdu leur plasmide Ri. La présence de ce dernier peut alors être recherchée chez la souche A4Km par le test G.U.S. (Annexe 3). L’influence de trois milieux est évaluée sur l’aptitude des racines à croître en milieu solide: M.S., M.S. + GA3, B5 (Annexe 4). Lorsqu’elles ont atteint une taille de un centimètre ou plus, elles sont excisées puis placées en milieu solide. Lorsque les racines ont montré leur capacité à croître de manière isolée en s'allongeant et en développant une structure ramifiée, elles sont aptes à être transférées dans un milieu de culture liquide.

I.1.3 Culture des racines en milieu liquide:

Jusqu’alors de taille réduite, les racines sont placées dans des tubes stériles de 10 ml, dans 2 ml de milieu B5, sous agitation, à la lumière. Les bouchons de ces tubes de culture in vitro ne sont pas scellés afin de ne pas asphyxier les racines (Figure 11).

Un essai de fiabilité de la technique de culture est effectué dans deux tubes du milieu bactérien L.B. avant d’entamer les cultures de racines. Le milieu L.B. est choisi car, si les tubes n'assuraient pas une culture stérile dans nos condition d'utilisation (agitation, inclinaison), les pathogènes s'y développeraient d'autant, trahissant l'anomalie.

Figure 11: Représentation schématique de la culture de racines isolées en milieu liquide.

I.2 Les plantes doublement transformées cultivées en serre:

Comparer les contenus alcaloïdiques de plantes entières nécessite de faire porter les dosages à un même niveau; par exemple sur la 3e feuille située sous le premier bourgeon à l’émission de ce dernier, sur des individus de tailles identiques (Figure 12). Ces derniers points sont difficiles à respecter car les plantes cultivées en serre ne fleurissent pas à un même niveau de croissance. Pour se rapprocher le plus d’un modèle de comparaison, nous allons déterminer un rapport feuille/racines pour chaque individu, dont les prélèvements sont effectués sur des feuilles de deux niveaux différents, à l’émission du bouton floral et à sa floraison.

Figure 12: Illustration des insertions foliaires sur un pied de Datura innoxia et du choix de leur numérotation.

I.3 Obtention de la première génération issue des jeunes plantes transformées:

On peut prévoir que parmi la première génération de graines, issues de plantes transformées par A. tumefaciens, se trouvent des individus transformés à l’état homozygote. L’étude de l’influence du gène P5CR chez de tels individus revêt alors tout son intérêt, d’où la nécessité d’assurer l’autofécondation des plantes mères.

Avant éclosion, le bouton floral a été recouvert d'un capuchon de papier et ce, jusqu’à ce que se développe le fruit épineux, afin d'assurer l'autofécondation des plantes (Planche 3). A l’ouverture de la capsule, le fruit est récolté, les graines en sont extraites et séchées à température ambiante dans du Sopalin.

Les graines sont désinfectées cinq minutes à l’eau oxygénée 110 volumes, puis cinq minutes à l’hypochlorite de calcium 7%, avant d’être mises en germination. Le milieu de germination est additionné de 250 mg/l de kanamycine pour exercer une sélection positive sur les individus transformés.

I.3.1 Vérification du caractère transgénique des plantes issues d’autofécondations:

Le fait de présenter la capacité de croître sur le milieu de sélection, ne présente pas une preuve définitive du caractère transformé des plantes. Pour caractériser l’état transgénique, il nous faut rechercher la présence au sein de leur génome, de séquences caractéristiques du gène incriminé. Cette recherche peut s’effectuer par P.C.R. (Polymerase Chain Reaction; voir l’Annexe 5) ou par test de Southern. Nous réaliserons une P.C.R. sur le gène NPTII.

4 µl de bleu de bromophénol et 10 µl d’eau sont ajoutés aux 10 µl d’échantillons issus de P.C.R. avant de déposer de ceux-ci (24 µl) dans les puits du gel de migration. Le gel est à 0,8 % d'agarose, la migration s’effectue à 100 volts durant 30 minutes dans du tampon T.A.E. (Annexe 5).

II · Extraction-dosage des alcaloïdes:

II.1 Analyses par H.P.L.C.:

C'est l'H.P.L.C. qui a été choisie au Laboratoire A.E.B. pour quantifier les alcaloïdes tropaniques. La phase mobile utilisée est constituée par un mélange d'eau, d'acétonitrile 150%0 et d'acide phosphorique, le pH est ajusté à 2,2 [Mandal S. 1991]. Disposant d'une nouvelle colonne C18 « YMC-Pack J’sphere ODS-AQ M80 » (80 Å, 4µm, 150 X 4,6 mm), notre première tâche est de chercher à adapter la concentration en acétonitrile de la phase mobile, pour optimiser la qualité de séparation des pics. La phase stationnaire est constituée de particules de Silice de 4µm de diamètre, à la surface desquelles sont greffées des chaînes aliphatiques à 18 carbones:

Si - O - Si - (CH2)17 - CH3

De part les propriétés chromatographiques de la Silice greffée, les dosages s’effectueront en phase inverse, où le composé à analyser sera d’autant retenu par la phase stationnaire qu’il sera hydrophobe; son temps de rétention en sera d’autant élevé. En ce qui nous concerne, la scopolamine aura un temps de rétention inférieur à l'hyoscyamine.

Les alcaloïdes tropaniques, de par leurs propriétés physiques, seront détectés par un spectrophotomètre U.V. à 204 nm.

II.1.1 Les plantes en serre transformées:

Concernant les plantes en serre, les dosages porteront, pour chaque plante, sur les alcaloïdes foliaires et racinaires. Chacune des plantes ayant en effet subi un événement transformationnel propre, il convient pour faire ressortir une éventuelle incidence de la dite transformation, de mesurer les contenus alcaloïdiques de chacune des plantes. Le stade physiologique, la taille de chaque individu étant susceptibles d’influer sur ce facteur, nous établirons, comme indiqué en Matériel & Méthodes « II. Les plantes doublement transformées cultivées en serre », les rapports alcaloïdiques feuilles/racines.

II.1.1.1 Extraction-dosage des alcaloïdes racinaires:

Les racines sont prélevées aléatoirement sur la plante, en évitant les parties âgées et nécrosées lorsqu’il y en a. Les racines sont aussitôt séchées à 60°C durant 24 à 48 heures. Des fractions de 10 mg de matière sèche (ou M.S.) finement broyées sont mises en contact avec 1 ml de méthanol et agitées durant deux heures. A l’issue de ce laps de temps, les extraits sont filtrés sur 0,22 µm et prêts à être dosés par H.P.L.C.

Afin de cerner les conditions de dosage, différents essais sont effectués ayant pour but de déterminer la concentration en M.S., la durée d’agitation, l’homogénéité du broyage, les parties de l’explant les plus riches.

II.1.1.2 Extraction-dosage des alcaloïdes foliaires:

Le matériel foliaire étant plus disponible que le matériel racinaire , mais aussi plus riche en substances étrangères (comme la chlorophylle par exemple), une méthode d’extraction-purification plus poussée lui sera appliquée.

100 mg d’échantillon foliaire sec sont broyés très finement et agités trois heures durant dans un solvant d’extraction dont la composition est donnée en Annexe 6.1. L’extrait est filtré et évaporé au rotavapor (Annexe 6.2). Les résidus sont repris dans une ampoule à décanter par deux fois 30 ml d’HCl 0,1 N. Après ajout de 30 ml de chloroforme, la solution est basifiée jusqu’à pH 9 par ajout de quelques gouttes de NH4+ puis agitée vigoureusement. Après décantation, la phase chloroformique -inférieure- est récupérée, et 30 ml de chloroforme sont rajoutés à la phase aqueuse dans l’ampoule à décanter et l’opération est répétée deux fois. L’extrait chloroformique recueilli est évaporé au rotavapor et l’étape de purification par partition de phase est recommencée. Deux derniers cycles d’évaporation et de partition de phase s’ensuivent, avant de reprendre les résidus dans 3 ml d’éluant H.P.L.C. (M.A.F., voir en Annexe 6.3) filtré sur 0,22 µm pour dégazer la solution.

Afin de cerner les conditions de dosage, différents essais sont, là aussi, effectués en vue de comparer les valeurs obtenues par cette méthode d’extraction-purification à celles d’une extraction au méthanol. Les alcaloïdes foliaires de chaque plante sont analysés par H.P.L.C. sur environ 5 et 10 mg de M.S. selon deux méthodes d’extraction. Chaque feuille est partagée en dix fractions, qui constitueront cinq répétitions de chaque série de M.S.

II.1.2 Les racines doublement transformées:

L’opération d’extraction et de dosage des racines doublement transformées suit la même procédure que les racines des plantes cultivées en serre.

II.2 Technique de dosage sur C.C.M.:

II.2.1 Préparation du matériel et dosage:

Préalablement à l'élaboration d'un protocole de séparation et révélation des alcaloïdes, il convient de rechercher la longueur d’onde à laquelle les solutions de spots vont être lus au spectrophotomètre. Pour ce faire, on pratique des injections de 5, 10, 20 et 40µl des dites solutions pour en déterminer la longueur d’onde d’absorption maximale.

Une étape d'extraction et de purification des échantillons précède les dépôts sur plaque, afin d’obtenir un chromatogramme lisible.

0,1 gramme de poudre de racines sont mouillées avec de l'ammoniaque à 28% et mélangées à 0,7g de poudre d'alumine. 3 ml de chloroforme sont ajoutés au mélange dans un tube à hémolyse, puis le tout est agité une nuit durant. Le contenu du tube est alors versé dans une colonne frittée et rincé par deux fois un ml de chloroforme. L'éluat est recueilli dans un tube et évaporé à sec au bain marie. Le culot est repris dans 250 µl d’eau puis centrifugé deux minutes à 8000 trs.mn-1. Dès lors, le surnagent peut être déposé sur une plaque de silice, à raison de 25 µl par essai et 10 µl par étalon d'hyoscyamine à 1% dans du méthanol. Pour que la définition du chromatogramme soit satisfaisante, les dépôts, au nombre de treize maximum, doivent être espacé de 1,3 cm au moins et se présenter sous la forme d'une tache étroite et régulière.

La migration s'effectue à l'obscurité dans un solvant composé de 50 ml de chloroforme, 10 d'éthanol absolu et 0,5 ml d'ammoniaque 28%. Une seconde migration s'ensuit après séchage, qui a pour effet d’accroître le sensibilité de la révélation; cette dernière s'effectuant au Dragendorff. En vue de quantifier la teneur alcaloïdique de chaque spot, ceux-ci sont grattés individuellement dans un ml d'eau distillée, vortéxés puis agités durant dix minutes. Après centrifugation deux minutes à 8000 trs. mn-1, le surnageant est placé dans une cuve à spectrophotomètre et son absorbance est mesurée à la longueur d'onde d'absorbance maximale précédemment déterminée contre de l'eau distillée.

Plusieurs tests sur les mesures par C.C.M. ont été effectués. Ils visent à cerner la précision, la sensibilité et la reproductibilité des mesures.

II.2.2 Tests concernant la précision des mesures:

Des mesures sur des concentrations variables d’échantillons et de solutions témoin sont pratiquées, et menées parallèlement aux mêmes mesures sur H.P.L.C.

II.2.3 Tests concernant la sensibilité des mesures:

Des dépôts de volumes croisants d'échantillons sont pratiqués, qui correspondent à des quantités croissantes de matière sèche. Si la méthode de dosage est sensible, la relation entre l'absorbance lue au spectrophotomètre et les quantités d'échantillons déposés suivra une droite.

II.2.4 Tests concernant la reproductibilité des mesures:

Un même échantillon sec réduit en poudre est soumis au protocole d'extraction des alcaloïdes par trois personnes différentes. Ces mêmes trois personnes assurent également les dépôts sur une seule plaque, qui sont mis à migrer de concert.

Résultats et discussion

Nous aborderons, dans cette partie, les aspects inhérents à l’entretien de la première génération de plantes transformées avec le gène P5CR, à l’obtention de racines doublement transformées, puis de chevelus racinaires et au dosage des alcaloïdes tropaniques, par H.P.L.C. et C.C.M.

I. Initiation et entretien du matériel végétal:

Au début de mon stage, je disposais en serre de plantes transformées par Ducrocq C. (1995). Celles-ci, régénérées à partir des disques foliaires, portent les lettres de A à G. Elles ont été multipliées par bouturages et cultivées en serre jusqu’à leur floraison. Les boutures, au nombre de 20, sont actuellement nommées de la façon suivante: T; T1; A1; A2; B1; B2; B3; B4; B5; B6; C; D1; D2; E1; E3; E4; E5; F1; F2; G1, où T sont des plantes témoin, non transformées.

I.1 Première génération de plantes transformées par le gène P5CR:

Afin d’étudier l’influence de l’insertion du gène P5CR sur une première génération, les plantes mères cultivées en serre ont été autofécondées. Les graines obtenues ont été semées sur milieu se sélection (kanamycine), afin de trier les individus transformés. Un certain nombre de résultats sont regroupés dans le Tableau 5.

Tableau 5: Données recueillies relatives aux plantes issues d’autofécondations.

Plantes fleuriessur un total de 20 plantes	12
Pourcentage de germination des graines sur milieu de sélection*(pour 200 graines mises en culture)	50%
Nombre moyen de capsules recueillies par plante	2

* Remarquons le faible pourcentage de germination des graines. Ceci peut traduire l'absence du gène de résistance à la kanamycine (NPTII), mais peut aussi être imputable à la technique de mise en germination des graines. L'embryon est en effet susceptible de mal supporter sa dissection.

I.2 Initiation et entretien des vitroplants transformés par P5CR:

Quelques uns de ces vitroplants, transformés par Ducrocq C. en 1995, étaient disponibles in vitro au Laboratoire A.E.B. lors de mon arrivée. Ils sont actuellement multipliés en de nombreux sous-repiquages d'un clone, numéroté "2". De nouveaux vitroplants ont été régénérés de fragments foliaires des plantes transformées et cultivées en serre, selon Ducrocq C. (1995). Ces fragments foliaires ont subi, sur milieu de sélection (kanamycine à 250 mg/l), une dédifférenciation tissulaire (callogenèse), puis une organogenèse jusqu’à développer, des bourgeons (Planche 2).

Le développement des bourgeons se poursuit sur un milieu d’élongation (MSB1) jusqu’au stade de jeunes plantes, puis ces dernières sont placées sur un milieu d’enracinement. A ce niveau de développement, un phénomène de vitrification peut s'emparer des explants, obligeant à de fréquents repiquages et nettoyages. Ce fait, allant jusqu’à la perte de l’explant, a été endigué au terme de quelques semaines par des repiquages sur un milieu appauvri de moitié en ses constituants minéraux et renforcé en agar (10 g/l au lieu de 8g/l) (Planche 4). La phloridzine, réputée efficace contre la vitrification s’est avérée inefficace à raison de 10 mg/l dans les milieux de culture.

Quelques semaines après que la situation se soit rétablie, les explants sont à nouveau cultivés dans les conditions initiales. Ils se développent ainsi jusqu’à atteindre une longueur d’entre-noeud de 1 cm, les disposant à subir une transformation par Agrobacterium rhizogenes.

I.3 Obtention des clones racinaires:

I.3.1 Transformation des vitroplants:

Comme indiqué pour la Figure 6 en Synthèse bibliographique V.1 « Principe de la transformation », les jeunes plantes sont piquées à l'aide d'une aiguille portant à son extrémité une souche bactérienne Agrobacterium rhizogenes A4 ou A4Km.

Dix à vingt-cinq jours après la piqûre, les premières racines néoformées commencent à poindre. Une moyenne de quatre à cinq racines néoformées apparaissent quasi simultanément par plantule transformée par A4. Elles sont excisées lorsqu’elles ont atteint une taille de 1,5 cm environ, pour être cultivées en milieu solide. Une vingtaine de jours plus tard, nous disposons d’un groupe d’explants producteur de racines transformées par les deux souches Agrobactéries.

La souche A4Km n’ayant pas généré de racines et le plasmide transformant n’ayant pas été identifié par test de biologie moléculaire (test G.U.S.), une souche neuve, conservée à -80°C contenant le plasmide transformant, a été utilisée pour transformer d’autres plantes. Des deux souches, la A4 s’avère la plus virulente, générant un plus grand nombre de racines (cité ci-dessus) par individu piqué.

I.3.2 Transformation de jeunes plantes issues de germinations:

Les jeunes plantes cultivées in vitro, ont atteint une taille suffisante pour être transformées par Agrobacterium rhizogenes. Dix sont actuellement transformées par la souche A4 et génèrent des racines adventives.

I.4 Entretien de clones racinaires:

I.4.1 En milieu solide:

Des trois milieux essayés pour leur action positive sur le développement des racines isolées (M.S.+ GA3, B5, M.S.), le milieu M.S. additionné de 0,8 mg/l de GA3 est le plus efficace. Il est choisi pour y déposer les racines nouvellement excisées. Elles y croissent et y développent rapidement une émission semblable à un petit chevelu. Plus d’une centaine de racines vigoureuses, issues d’une cinquantaine de plantules transformées est recueillie.

Ayant atteint une taille et un degré de ramification jugés suffisants (voir en I.4.2 « En milieu liquide »), les racines sont alors transférées dans un tube de milieu liquide (Planche 5). Il est difficile d’apprécier le degré de ramification des racines. Quoi qu’il en soit, il semble préférable de les laisser se développer jusqu'à une taille globale de quelques centimètres, avant de les transférer en milieu liquide.

I.4.2 En milieu liquide:

Cent cinquante racines sont, progressivement, transférées pour entamer leur culture en milieu liquide de Gamborg. Dès la première semaine de culture, certains tubes présentent un voile trahissant la présence de contaminations. Il n’est pas rare, en effet, que les racines transgéniques relarguent les bactéries par lesquelles elles ont été transformées. La solution pour amener les racines à l’état axénique est de les repiquer assidûment en présence d’antibiotiques.

Malgré cela, les racines restent dans un état élevé de contamination, qui se retrouve progressivement dans l‘ensemble des cultures. Des concentrations en céfotaxime, carbénicilline, autres antibiotiques de 800 mg/l ne permettant pas mieux d’espacer la fréquence des repiquages, des échantillons commencent à se nécroser.

La résistance peu commune des germes incriminés pousse à la curiosité. Un état frais des prélèvements de milieu révèle, sous le microscope, la présence non pas de bactéries, mais de levures. Tous les explants contaminés se révèlent l’être par ces micro-organismes, qui ont tôt fait de réduire à néant la collection de futurs chevelus racinaires.

L’origine aérienne des levures est suspectée. Un nouvel essai, avec du milieu L.B. (Annexe 6.4) est pratiqué sur un portoir de vingt-quatre tubes, qui sont débouchés et rebouchés stérilement pour simuler les séances de repiquage. De la même manière que précédemment, des contaminations sporadiques apparaissent dans tous les tubes. Il s’agit là encore de levures.

Visiblement, les tubes de culture sont en cause. Afin d’éviter cet ennui, les bouchons des tubes sont remplacés par des bouchons de cellulose stériles et scellés. La répétition de l’essai précédant dans ces conditions ne montre pas de contamination.

Les racines issues d’un nouveau groupe de plantules sont cultivées selon ce système.

Par souci de rendement, les vitroplants non encore tranformés le sont par Agrobacterium rhizogenes A4 (la plus virulente), sauf trois, par la souche A4Km.

Rappelons à ce niveau un facteur décisif, observé dans le développement des racines doublement transformées en chevelus racinaires. La taille et le degré de ramification des racines isolées et entretenues en milieu solide semblent importants: passées trop précocement en milieu liquide elles se sont en effet avérées inaptes à s'y développer. Il semble donc important et plus approprié d'exciser les racines plus tardivement de la plante originelle (lorsqu'elles ont atteint une taille de quelques centimètres), de les laisser se ramifier davantage sur milieu solide avant de les transférer en tube agité. La mise en application de cette observation porte ses fruits; cinq racines (seulement car faute de temps) ont pu être amenées au stade de chevelus racinaires. Les transferts de racines en milieu liquide se poursuivent cependant encore.

II. Analyse du contenu alcaloïdique:

II.1 Amélioration de la technique de dosage par H.P.L.C.:

L'analyse par H.P.L.C. nous donne un chromatogramme constitué de pics plus ou moins bien séparés. La recherche d'une phase mobile plus adaptée à notre colonne, nous a conduit à utiliser un éluant, légèrement différent de celui décrit par Mandal et al. en 1992. La composition de notre éluant est la suivante:

900 ml d'eau distillée,

108 ml d'acétonitrile,

2,7 ml d'acide orthophosphorique,

0,9g de KH2PO4.

Le pH est amené à 3 avec de la triéthylamine.

Le premier pic apparaissant sur le chromatogramme est souvent celui du solvant, dont le temps de rétention correspond au « volume mort » séparant la chambre d’injection du détecteur. Les pics suivants, dont les temps de rétention caractérisent les substances présentes dans la solution à analyser, mettent un certain temps à sortir. Il a été remarqué, que les temps de rétention des composés variaient considérablement selon le mode de filtrage de l'éluant. Il est possible que l'efficacité du procédé agisse au niveau de la pression partielle de l'un ou plusieurs des constituants de l'éluant, tel que l'acétonitrile ou l'oxygène dissout. Cette observation mériterait d’être confirmée par des mesures répétées, effectuées avec un éluant filtré selon les deux procédés disponibles (trompe à vide et pompe électrique).

Un élément important du chromatogramme est la surface des pics, qui est proportionnelle à la quantité de chacun des produits qu’elle représente, et donc à leur concentration dans la solution injectée. On définit la relation suivante:

A= H X wh; où A est l’aire du pic, H sa hauteur, wh sa largeur à mi-hauteur.

On remarque sur les chromatogrammes de la Figure 13, la longueur d’une analyse par H.P.L.C.; jusqu’à près d’une heure. On se rend compte de ce fait, que les échantillons, -nombreux- à analyser puissent s’accumuler plus vite qu’il ne sont traités, même en dégazant avec une pompoe électrique. Une alternative à cela consiste à les stocker transitoirement à -20°C. Afin de vérifier la stabilité de cette solution, des échantillons, illustrés sur la Figure 15, ont été dosés à cinq mois d’intervalle.

Figure 13: Exemple de chromatogrammes (solutions étalon).

Chromatogramme d’étalon de scopolamine (S) et d’hyoscyamine (H) à 10 mg/ml.

· Chromatogramme d’étalon de scopolamine (S) et d’hyoscyamine (H) à 10 mg/ml.

Il semblerait selon les résultats de la Figure 14, qu’il y ait une légère diminution des teneurs en hyoscyamine au cours du temps; les rapports des concentrations étant de 1,1 à 1,5. Néanmoins, ces mesures ne concernaient que peu d’échantillons et demandent à être confirmées.

Figure 14: Variation en cinq mois des teneurs en hyoscyamine d’extraits racinaires stockés à -20°C.

L'autre alternative serait de soulanger la chaîne H.P.L.C. et d'accélérer la cadence des dosages par un autre biais.

II.2 Mise au point d’une technique d’analyse rapide en C.C.M.:

II.2.1 Recherche d'un solvant et d'un révélateur:

Deux solvants proposés dans la littérature sont testés. L'un est composé de chloroforme, d'éthanol et d'ammoniaque [Ansarin et Wolley 1995], l'autre est composé d'acétone, d'eau et d'ammoniaque [Wagner et al. 1995]. La séparation de l'hyoscyamine des autres composants est meilleure avec l'éluant contenant du chloroforme; c'est donc ce solvant qui sera utilisé pour la suite des manipulations (Annexe 7).

Le réactif de Dragendorff est utilisé pour révéler les spots, car il est plus économique et moins dangereux que l'iode, et donne les mêmes résultats.

II.2.2 Recherche de la longueur d’onde de dosage:

La longueur d’onde d'absorption maximale des spots révélés est recherchée sur quatre essais de 5, 10, 20, 40µl d'hyoscyamine, contre de l'eau. Comme le montre la Figure 15 pour un spectre à 20 µg/ml d'hyoscyamine, la valeur recherchée se situe, comme pour l'ensemble des spectres mesurés, à 288 nm. C'est à cette longueur d'onde que seront analysés les essais ultérieurs.

Figure 15: Spectre d'absorption d'une solution aqueuse de 20 µl/ml d'hyoscyamine.

II.2.3 Tests concernant la précision des mesures:

Nous avons comparé deux techniques d'analyses: C.C.M. et H.P.L.C., sur des échantillons identiques. Le Tableau 6 en donne les valeurs.

Selon le Tableau 6, les mesures par C.C.M. donnent des valeurs supérieures à celles par H.P.L.C. Néanmoins, on peut considérer que les valeurs sont satisfaisantes, compte tenu des intervalles de confiance de chaque technique et de la relative précision que l'on attend des mesures par C.C.M. Pour l'utilité allouée à cette technique, 30% d'erreur au maximum sont tolérés.

Tableau 6: teneurs alcaloïdiques (hyoscyamine + scopolamine) mesurées conjointement par H.P.L.C. et C.C.M. (D.O. à 288 nm). Les pourcentages sont exprimés en d'alcaloïdes pour mg /100g M.S.

Echantillons Résultats C.C.M. Résultats Variations C.C.M.-

Valeurs Moyenne Conc. H.P.L.C. H.P.L.C.

0,211

Témoin 10 mg/ml 0,288 0,245 10 mg ml 10 mg ml -

0,236 +/- 17% +/- 15%

0,208

Essai 1 0,221 0,206 0,8 % 0,6 % 28,6 %

0,190 +/- 15% +/- 15%

0,104

Essai 2 0,104 0,108 0,5 % 0,27 % 29,9 %

0,116 +/- 11% +/- 15%

Essai 1: parties jeunes des racines (apex). Essai 2: parties plus âgées des racines.

II.2.4 Tests concernant la sensibilité des mesures:

Une première approche pour cerner le seuil de détection de la méthode a consisté à effectuer des dépôts d'une solution d'hyoscyamine à 0,001%, 0,01%, 0,1% et 1% (0,025 mg - 0,25 mg - 2,5 mg - 25 mg). Après révélation, seul le spot d'hyoscyamine à 1% étant visible, on en déduit que le seuil de détection se situe vers cet ordre de valeur.

La linéarité de la courbe d’absorbance, évaluée en fonction des quantités d’échantillons et de solutions étalon déposées, est représentée sur les Figures 16 et 17.

Le calcul du coefficient de corrélation r de la courbe ci-dessus nous donne r= 0,97.

On remarque la linéarité des mesures effectuées sur une solution étalon (Figure 17), dont le coefficient de corrélation est de 0,983. Par souci de comparaison, on peut se référer à la Figure 18, qui représente les mesures par H.P.L.C. du même test.

Il ressort de ces manipulations que la méthode de dosage par C.C.M. donne, sur une même série, des résultats cohérents, pour des dépôts d'hyoscyamine supérieurs ou égaux à 30 mg (30 µl à 1%). Les données suivantes illustrent la fiabilité de la méthode sur des répétition d'une même série par un ou plusieurs manipulateurs.

Figure 16: mesure de la sensibilité des mesures d'échantillons par C.C.M.

Figure 17: Mesure par C.C.M. de la sensibilité de dosage de solutions étalon d'hyoscyamine.

Figure 18: Mesure par H.P.L.C. de la sensibilité de dosage de solutions étalon d'hyoscyamine.

II.2.5 Tests concernant la reproductibilité des mesures:

Les résultats des mesures, effectuées par trois personnes différentes sur un même échantillon, montent des différences, pouvant être induites au cours de quatre phases de l’opération d’extraction-purification-dosage:

- Recueil des alcaloïdes dans le chloroforme;

Il est en effet nécessaire de gratter méticuleusement les parois du récipient pour remettre les alcaloïdes en solution.

- Dépôt de la solution chloroformique sur la plaque C.C.M.;

Une tache de dépôt petite et régulière donne un spot distinct et donc plus aisé à recueillir qu’un spot diffus.

- Grattage des spots après révélation;

Il convient d’apprécier les limites du spot et de reproduire le même critère de discernement pour les autres spots. Ne serait-ce que sur ce point, le travail effectué par deux personnes est grandement susceptible de différer.

- Lecture au spectrophotomètre;

Le culot de poudre de silice n’est pas très compact au fond du tube Eppendorf; de fines particules peuvent être remises involontairement en suspension, perturbant ou faussant la mesure au spectrophotomètre.

Les paramètres énumérés ci-dessus influent largement sur la reproductibilité des mesures entre plusieurs manipulateurs. Il semblerait donc qu’il faille standardiser davantage la méthode pour la rendre praticable en routine.

Des mesures de reproductibilité effectuées par une même personne donnent les résultats présentés en Figure 19. Trois essais d’un même échantillon, sont extraits, déposés en double sur deux plaques C.C.M. et analysés individuellement. Les variations entre doubles dépots varient entre 13 et 29% . Les variations des analyses entre deux plaques de silice ne sont pas supérieures aux écarts mesurés entre échantillons sur une même plaque, ni même à celles accompagnant les dosages par H.P.L.C., qui sont de l'ordre de 15%.

Figure 19: Essais de reproductibilité d’échantillons mesurés par C.C.M. par une personne.

Il semblerait donc qu’il faille standardiser davantage la méthode pour la rendre praticable en routine, en diminuant les causes de variation des mesures. Une cause de variations est constituée par la stabilité de coloration du révélateur. Celle-ci se dégrade au cours du temps, obligeant à doser les échantillons au spectrophotomètre dans l'instant (Tableau 7); problème qui ne se pose pas si l'on dose ces mêmes échantillons par H.P.L.C.

Tableau 7: Evolution en trois jours, des teneurs en hyoscyamine, mesurées par spectrophotométrie U.V. à 288 nm.

Echantillons Absorbance mesurée par spectrophotométrie

le jour du grattage 3 jours plus tard

S1 0,071 0,037

S2 0,087 0,049

S3 0,069 0,040

Taux de diminution moyen 44,7%

II.3 Analyse des clones racinaires:

II.3.1 Clone stabilisé:

Nous disposons, au laboratoire A.E.B., d’une lignée de chevelus racinaires initiée par Ducrocq C. en 1995, par le biais d’Agrobacterium rhizogenes A4Km. Cette souche est conservée par repiquages toutes les trois semaines dans du milieu B5 liquide (Annexe 7).

Un volet de l’optimisation de la technique de dosage a consisté à se rendre compte de différences entre les parties jeunes (aux apex) et âgées (vers la base des racines). La Figure 20 illustre ces différences.

Avec des moyennes de 214,3 et 731,0 mg/100g, il apparaît clairement des différences, allant du simple au triple (rapport de 3,4) entre les contenus des deux zones racinaires.

II.3.2 Issues de vitroplants transformées:

La séparation des pics par H.P.L.C. est insuffisante pour certains échantillons; les mesures en sont moins précises, lorsqu'il n'est pas impossible de discerner un pic complètement masqué par un autre. Il faut donc chercher à accroître le pouvoir de séparation de la phase mobile employée. A cet effet, un premier solvant est préparé. L'acétonitrile ayant la propriété d'augmenter le pouvoir d'élution de la phase mobile, différentes proportions sont employées: 35%0, 40%0, et 250%0. Après comparaison des résolutions obtenues, une solution à 100%0 d'acétonitrile est préparée. Les échantillons, racinaires mais aussi foliaires, seront dosés avec cette solution, qui engendre une séparation convenable des pics (Annexe 8).

Figure 20: Quantifications d’hyoscyamine présente dans les parties racinaires jeunes (apex) et âgées (zone basale).

II.3.3 Issues de la première génération de plantes P5CR:

Les plantes, issues d’autofécondations, transformées par la souche Agrobacterium rhizogenes ont développé des racines croissant sur un milieu M.S. solide additionné de kanamycine. Il est encore trop tôt pour pouvoir en développer des chevelus racinaires abondants.

II.4 Analyse des plantes transgéniques P5CR:

II.4.1 Plantes d’origine:

Les plantes « d’origine » sont celles initiées par Ducrocq C. en 1995 et cultivées en serre. Les mesures portent sur les plantes telles qu’elles se trouvaient à mon arrivée, avant que des bouturages ne soient pratiqués. La Figure 21 présente les concentrations racinaires en hyoscyamine mesurées par H.P.L.C. avec des quantités de matière sèche et des volumes de solvants d’extraction variables. Le protocole d’extraction utilisé jusqu’alors utilisant 1 ml de méthanol sur des quantités de racines de 5 à 10 mg M.S., cette manipulation a pour objet d’observer si le solvant d’extraction ne se sature pas en hyoscyamine, ce qui aurait pour but de fausser les mesures.

Au vu de l’intervalle de confiance des mesures (15%), il apparaît que l’on peut pratiquer les extractions sur 4 à 30 mg de racines sèches, avec un ou deux ml de méthanol. Ce résultat est satisfaisant, car il est en pratique plus aisé de travailler sur des masses de l’ordre de dix mg. Cet ordre de grandeur permet de prélever les racines sur les plantes en serre, sans léser ces premières.

Figure 21: Contenu en hyoscyamine (mg/100g M.S.) de racines de D. innoxia. L'extraction a été pratiquée avec 1 et 2 ml de méthanol.

Etablir les rapports alcaloïdiques feuilles/racines pour chacune des plantes cultivées en serre, passe par un protocole d'extraction au rotavapor, long et de faible rendement. Des essais ont été menés sur des masses foliaires sèches de l'ordre de 5 et 10 mg, dont les alcaloïdes ont été extraits au méthanol. Les valeurs, présentées dans le Tableau 8, sont en cours d'analyse par H.P.L.C. et sont destinées à être comparées à celles issues du protocole classique d'extraction au rotavapor.

Tableau 8: Comparaison de deux procédés d’extraction des alcaloïdes foliaires. {Données provisoires , sujettes à des vérifications ultérieures}.

Légende:

Témoin négatif: l'échantillon est remplacé par de l'eau distillée stérile.

Témoin positif: l'échantillon est remplacé par de l' ADN bactérien renfermant le gène NPTII.

L'échantillon est préparé selon la technique de Edwards et al. de 1991.

La P.C.R. de la Figure 22 montre, chez deux des échantillons présentés, une bande de 210 kb qui correspond la présence du gène NPTII ( ). On peut donc en conclure que les plantes correspondantes ont effectivement été transformées par Agrobacterium tumefaciens. Certains échantillons ne présentent pas la bande correspondante ( ) au gène NPTII, ce qui peut indiquer soit une erreur de manipulation, soit que les plantes n'ont pas été transformées. Une deuxième P.C.R. sur ces explants est donc à réaliser. Les plantes de première génération, peuvent posséder les deux gènes transférés par Agrobacterium tumefaciens: P5CR et NPTII, ce qui est reconnu comme étant le cas le plus fréquent. L'un d'entre eux seulement peut avoir été transmis. En effet, bien qu’associés lors de la transformation des plantes mère, le gène de sélection et le gène d’intérêt sont susceptibles de subir des ségrégations distinctes au cours de la méïose intervenant dans la génération des graines. Une P.C.R. positive pour le gène NPTII traduit donc l'état transformé des plantes, mais pas la présence du gène P5CR. Ce cas de figure est néanmoins suffisamment rare, pour que l'on puisse se fier au seul critère de résistance au milieu de sélection, ici confirmé par P.C.R..

Conclusion et perspectives

La transformation et la régénération du Datura innoxia Mill. au laboratoire A.E.B. sont maîtrisées depuis les travaux de Ducrocq C. en 1995. Depuis lors, l’établissement de chevelus racinaires doublement transformés n’avait pu être répété, Debierre-Grockiego F. s’étant heurtée dès 1995 à un problème de transition, lors du passage des racines du milieu de culture solide en milieu liquide. Il semblerait actuellement qu’il faille exciser les racines néoformées de l’explant lorsqu’elles ont atteint une taille de quelques centimètres et les laisser se ramifier davantage en milieu solide, avant de poursuivre leur développement en milieu liquide agité. Après adaptation des conditions de culture, un certain nombre de chevelus racinaires a été obtenu et le procédé est à présent maîtrisé.

Une technique de pré-dosage des alcaloïdes par C.C.M. a été développée, qui s'avérera des plus utiles pour établir une étude statistique sur l’influence de la double transformation chez Datura innoxia. Rappelons en effet que la longueur d’un dosage par H.P.L.C., reste encore inadaptée à l’étude de nombreux échantillons. Des essais ont par ailleurs permis de cerner les limites de techniques d’extraction des alcaloïdes tropaniques, ouvrant ainsi la possibilité d’en simplifier grandement la procédure.

Des mesures sont en cours pour comparer les teneurs alcaloïdiques de plantes transformées entières. On peut en attendre l’établissement d’un protocole d’échantillonnage et de dosage simplifié, ce qui ne manquera pas de s’avérer utile pour poursuivre et mener à bien l’ensemble du programme que j’ai abordé pendant mon stage de D.E.A.

Bibliographie

ANSARIN M. ET WOOLEY G., "The Biosynthesis of Tropic Acid. Part. 6. Enantioselective, Intact Incorporation of (R)- (+)- 3- Phenyllactic Acid into the Tropic Ester Alkaloids of Datura", J. Chem. Soc. Perkin Trans, p. 487-490, 1995.

BOITEL-CONTI M., GONTIER E., LABERCHE J.C., DUCROCQ C. and SANGWAN-NORREEL B.S., "Permeabilization of Datura innoxia Mill. hairy roots for release of stored tropane alkaloids", Planta Medica 61: 199-296, 1995.

BOITEL-CONTI M., GONTIER E., LABERCHE J.C., DUCROCQ C. and SANGWAN-NORREEL B.S., "Eliciting effects of tween-20 permeabilization for release of stored tropane alkaloids in Datura innoxia Mill. hairy roots ", Plant Cell Reports sous presse, 1996.

CHENIEUX J. C., "Apport des cultures in vitro dans l'étude de la régulation du métabolisme secondaire végétal", cinquantenaire de la culture in vitro Versailles, ed. INRA, p.110-122, 1990.

CHRISTEN P., AOKI T. AND SHIMOMURA K., "Characteristics of growth and tropane alkaloid production in Hyoscyamus albus hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes A4" , Plant Cell Reports, 11:297-600, 1992.

CHRISTEN P. et ROBERTS M.F., "Transformation in Datura Species", Biotechnology in agriculture and forestry, 22: 157-171, 1993.

CLARE B.G., "Agrobacterium in plant desease", Biological desease control and plant genetic engeneering, Sci. Progr. London, 74:1-13, 1990.

CORRY J. P., REED W. L. AND CURTIS W. R., "Enhanced recovery of Solavetivone from Agrobacterium transformed root cultures of Hyoscyamus muticus using integrated product extraction", Biotechnology and Bioengeneering, 42: 503-508, 1993.

COUGOUL N., MIGINIAC E. et COSSON L., "Un gradient métabolique: rapport scopolamine/hyoscyamine dans les feuilles du Duboisia myoporoides en fonction de leur niveau d'insertion et du stade de croissance", Phytochemistry, 18: 949-951, 1979.

DEBIERRE-GROCKIEGO F., "Transformation de Datura innoxia Mill. par Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes en vue d'augmenter la production d'alcaloïdes tropaniques (insertion d'un gène d'intérêt)", D.E.A. G.E.B.M. Université de Picardie Jules Verne, 50 p., 1995.

DELAUNAY A. J. ET VERMA D. P. S., "A soybean gene encoding pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated", Mol. Gen., 221: 299-305, 1990.

DENO H., YAMAGATA H., EMOTO T., YAMADA Y. AND FUJITA Y., "Scopolamine production by Roots cultures of Duboisia myopoides. Establisment of a hairy root culture by infection with Agrobacterium rhizogenes", J. Plant. Physiol. 131: 315-323, 1987.

DENTIN H., "Amélioration et optimisation des techniques d’études du contenu alcaloïdique des racines de Datura innoxia Mill.", rapport de stage de B.T.S. de Biochimie deuxième année, Lycée Delambre, Amiens, p.4, Juin 1996.

DESAILLY I., FLINIAUX M. A. ET JACQUIN-DUBREUIL A., "Etude de la distribution des alcaloïdes dérivés de l'acide tropique chez Datura stramonium L., par dosage immunoenzymatique: localisation tissilaire et subcellulaire", C.R Acad. Sci. Paris, t. 306, Série III, p. 591-596, 1988.

DUCROCQ C., "Transformation génétique d'une plante médicinale: la Datura innoxia Mill., par par l'intermédiaire d'Agrobacterium tumefaciens et d'Agrobacterium rhizogenes, et évaluation de la production de métabolites secondaires". Thèse doctorale Université Picardie Jules Verne (234 p.), 1994.

DUEZ P., CHAMART S., HANOCQ M. et MOLLE L., "Comparaison between thin-Layer Chromatography-densitometry and High Performance Liquid Chromatography for the determination of hyoscyamine and hyoscine in leaves, fruit and seeds of Datura (Datura spp.)", Journal of Chromatography, 529: 415-421, 1985.

EDWARDS K., JOHNSTONE C. ET THOMSON C., "A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis", Nucleic Acids Research, Vol.19 N° 6, 1991.

ERMAYANTI T. M., MCCOMB J. A. and O'BRIEN P. A., "Cytological analysis of seedlling roots, transformed roots cultures and roots regenerated from callus of Swainsona galegifolia (Andr.) R. Br.", Journal of Experimental Botany, vol. 44 n° 259: 375-380, 1993.

GAMBORG O.L., MILL.ER R.A. ET OJIMA K., "Nutrients requirements suspension cultures of soybean root cells", Experimental Cell Research, 50: 151-158, 1968.

GAUDIN V., VRAIN T. and JOUANIN L., "Bacterial genes modifying hormonal balances in plants", Plant physiol. biochem., 32 (1): 11-29, 1994.

GIULIETTI A. M., PARR A. J. et RHODES M. J. C., "Tropane alkaloid production in transformed root cultures of Brugmensia candida", Planta Medica, 59: 428-431, 1993.

GONTIER E., "Etude de la production d'alcaloïdes tropaniques chez le Datura innoxia Mill. cultivé in vitro: impact physiologique de l'immobilisation des cellules au sein d'une matrice d'alginate de calcium", Thèse de Doctorat, Université de Picardie Jules Verne, Amiens, 1993.

GONTIER E., FLINIAUX M. A., BARBOTIN J. N. et SANGWAN-NOREEL B. S., "Tropane alkaloid levels in the leaves of micropropagated Datura innoxia Mill. plants", Planta Medica, 59: 391-484, 1993.

GONTIER E., SANGWAN-NOREEL B. S. et BARBOTIN J. N. "Simulataneous determination of some tropane alkaloids by reverse phase H.P.L.C. of Datura innoxia Mill. plant material", Agro Food Industry Hi-Tech, 5: 26-28, 1994.

GONTIER E., SANGWAN-NOREEL B. S. et BARBOTIN J. N. "Effects of calcium, alginate, and calcium-alginate immobilization on growth and tropane alkaloid levels of stable suspension cell line of Datura innoxia Mill.", Plant Cell Reprts, 13: 533-536, 1994.

GRAHAM CRABBE P. and FRYER C. "Rapid quantitative analysis of solasodine, solasodine glycosides and solasodiene by High-Pressure Liquid Chromatography", Journal of Cromatography, 187: 87-100, 1980.

GUIVARC'H A., CAERNEIRO M., VILAINE F., PAUTOT V. et CHRIQUI D., "Tissue-specific expression of the rol A gene mediates morphological changes in transgenic tobacco", Plant Molecular Biology, 30: 125-134, 1996.

HASHIMOTO T., HAYASHI A., AMANO Y., KOHNO J., IWANARI H., USUDA S. et YAMADA y., "Hyoscyamine 6b-hydroxylase, an enzyme involved in tropane alcaloid biosynthesis, is localized at the pericycle of the root", The Journal of Biological Chemistry 266(7): 4648-4653, 1991.

HEBY O., "Role of polyamines in the control of cell proliferation and differentiation", Springer-Verlag, 19: 1-20, 1981.

HE LI-YI, ZHANG GUAN-DE and TONG YU-YI and KAZUHIKO SAGARA, TOSHIYUKI OSHIMA and TSUGUCHIKA YOSHIDA; "Reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatographic separation and determination of tropane alkaloids in Chinese solanaceous plants". Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdarn-Printed in The Netherlands, Journal of Chromatography 481: 428-33, 1989.

HOUGAARD D. M., "Polyamine phytochemistry: localisation and possible fonctions of polyamines", International review of cytology, 138: 51-87, 1992.

JANOT M.M., Encyclopaedia Universalis, A: 649-655, 1986.

MALDONADO-MENDOZA I. E., AYORA-TALAVERA T.R., et LOYOLA-VARGAS V. M., "Tropane alkaloid production in Datura stramonium root cultures", In vitro Cell. Dev. Biol., 28P: 67-72, 1992.

MARTIN F., "Etude de l'impact métabolique de la transformation génétique chez le Datura innoxia Mill.", Rapport de stage B.T.S. Biochimie, Lycée Delambre, Amiens, 1995.

MONFORTE-GONZALEZ et al., "Quantitative analysis of serpentine and ajmalicine in plant tissue of C.roseus and Scopolamine in root tissue of Datura stramonium by thin layer chromatography-desitometry", Phytochem. Analisis, 1992

MOREAU F., "Alcaloïdes et plantes alcaloïfères", Que sais-je, 126 pages, 1964.

MURASHIGE T. ET SKOOG F., "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures", Physiol. Plantarum, 15: 473-497, 1962.

KNOPP E., STRAUSS A. et WEHRLI W., "Root induction on several Solanaceae species by Agrobacterium rhizogenes and determination of root tropane alkaloid content", Plant Cell Reports, 7:590-593, 1988.

LINSMAIER E. F. et SKOOG F., "Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures", Physiol.Plant , 18: 100-127, 1965.

PARR A. J., PAYNE J., EAGLES J., CHAPMAN B.T., ROBINS R.J., RHODES M.J.C., "Variation in tropane alkaloid accumulation within the Solanaceae and strategies for its exploitation", Phytochemistry, 29: 2545-2550, 1990.

PAYNE J., HAMILL. J. D., ROBINS R. J. et RHODES M. J. C., "Production of Hyoscyamine by 'Hairy Root' cultures of Datura stramonium", Planta medica, 474-478, 1987.

PETIT A., DAVID C., DAHL G.A., ELLIS J.G., GUYON P., CASSE-DELBART F., TEMPE J., "Further extension in the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation", Mol. Gen. Genet., 190: 204-214, 1983.

PETRI G. et BAJAJ Y.P.S. "Datura spp.: in vitro regeneration and the production of tropanes", Biotechnology in Agriculture and Forestry, 7: 135-157, 1989.

PLANK K.H. et WAGNER K. G., "Determination of Hyoscyamine and Scopolamine in Datura innoxia plants by High Performance Liquid Chromatography", Z. Naturforsch 41 c: 391-395, 1986.

ROBINS R. J., PARR A. J., PAYNE J., WALTON N. J. et RHODES M. J. C., "Factors regulating tropane-alkaloid production in a transformed root culture of a Datura candida x D.aurea hybrid", Planta, 181: 414-422, 1990.

ROMEIKE A., "Zur biogenèse des scopolamins", Naturw, 46: 492493, 1959.

ROMEIKE A., "Sur la biogenèse de la scopolamine", Bull. Soc. Fr. Phys. Veg., 7:3335, 1965.

ROZYLO J. K., MALGORZATA J., RYSZARD S., "Advantages of C.C.M. as a pilot for H.P.L.C."; J. liq. Chromatography, 17: 3641-3653, 1994.

SANGWAN R.S., DUCROCQ C. et SANGWAN-NOREEL B.S., "Effect of cultural conditions on transformation of Datura innoxia Mill. by Agrobacterium tumeffaciens", Plant Cell Reports, 10: 90-93, 1991.

SAUERWEIN M., WINK M. et SHIMOMURA K., "Influence of light and phytohormones on alkaloid production in tranformed root cultures of Hyoscyamus albus", J. Plant Physiol., 140: 147-152, 1992.

SMITH E. F. et TOWSEND C. O., "A plant tumor of bacterial origin", Science, 25: 671-673, 1907.

SPENCER P.A. AND TOWERS G.H.N., "Specificity of signal compounds detected by Agrobacterium tumefaciens", Phytochemistry, 1988.

TIMOTHY ABRAHAM W. et LEETE E., "New intermediate in the biosynthesis of the tropane alkaloids in Datura innoxia", J. Am. Chem. Soc., 117: 8100-8105, 1995.

VERZAR-PETRI G., KIET D. H. and SZOKE E., "The alkaloid production in Datura innoxia tissue cultures", Acta Botanica Academiae Scientiarum Hungaricae, 24 (3-4): 351-361, 1978.

VAN DE VELDE H., DEMEYER K. and DEJAEGERE R., "Influence of IAA and DMAA on hyoscyamine and scopolamine production in Datura stramonium var.tatula"; Acta Agronomica, 37 (1-2), pp. 55-63, 1988.

VANHALA L., HILTUNEN R., and KIRSI-MARJA OKSMAN-CALDENTEY, " Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus", plant cell reports, 14: 236-240, 1994.

WAGNER W., BLADT S., ZGAINSKI E.M., "Plant drug analysis", Springer verlag Berlin, 51-304, 1995.

WALTER H. J. P. and GEUNS J. M. C., "High speed H.P.L.C. analysis of polyamines in plant tissues", Plant physiol. 83: 232-234, 1987.

WITTE L., MULLER K. ET ARFMANN H. A., "Investigation of the alkaloid pattern of Datura innoxia plants by capillarity Gas - Liquid - Chromatography - Mass Spectrometry", Planta Med., 7: 192-197, 1987.

YAMADA Y. et MINO M., "Instability of chromosomes and alkaloid content in cell llines derived from single protoplasts of cultured Coptis japonica cells", Current Topics in developmental Biology, 20: 409-417, 1986.

ZAENEN I., VAN LAREBEKE N., TEUCHY H., VAN MONTAGU M., SCHELL J., "Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains", J. Mol. Biol., 86: 109-127, 1974.

| H.P.L.C. | C.C.M. | PCR | Sommaire |