PROTOCOLE D'OBTENTION D'HYBRIDOMES
1* DESCRIPTION GENERALE
Les procédures utilisées pour la production d'anticorps monoclonaux suivent, pour l'essentiel, le protocole décrit initialement par KOHLER et MILSTEIN. Les différentes phases, sont les suivantes. Des cellules spléniques d'une souris immunisée sont récoltées stérilement. Certaines d'entre elles sont sécrétrices d'anticorps, mais aucune n'est capable de division prolongée in vitro. Elles sont fusionnées avec une culture de cellules d'un myélome HGPRT-. La population cellulaire est transférée en milieu sélectif1le plus fréquemment utilisé est le milieu HAT, (ne permettant pas la croissance des cellules HGPRT-). Les lymphocytes dégénèrent spontanément; des clones hybrides prolifèrent. Les cupules ou une croissance cellulaire se produit sont identifiées par observation microscopique et leur surnageant est testé contre l1antigène qui a servi à immuniser l'animal donneur. Les cellules des cupules positives sont reclonées suivant la technique de dilution limite afin de garantir la pureté génétique des différentes sous-cultures. Elles sont multipliées in-vitro puis inoculées à des souris histocompatibles chez lesquelles elles donnent naissance à des tumeurs ascitiques dont le fluide contient plusieurs milligrammes par millilitre d'anticorps monoclonal exprimant la spécificité choisie.
2*MILIEUX ET MATERIELS UTILISES
- Glutamine 200mb
Pyruvate de sodium 0.1 M
Streptomycine 100
Specilline 5 millions U
Milieu de base RPMI 1640
Sérum fœtal de veau
Hypoxanthine 10-2 dans l'eau
Azasérine 10-2 dans l'eau
Milieu normal d'entretien des cellules = Milieu complet
concentration finale
100 mi RPMI 1 ml Glutamine 2mM
1 ml Pyruvate de sodium 1 mM
0,1 ml Antibiotiques
10 ml Sérum 10%
Milieu sélectif
100 mi milieu complet + 0,1 mi Azasérine (l0-5M)
+ 0,5 ml Hypoxanthine (5.l0-5M)
3* MILIEU DE FUSION CELLULAIRE
solution de Polyéthylène Glycol (PEG) 1500 (BOEHRINGER) dans 75 mM Hépès PEG 50%,w/v.
4* MATERIEL
-Boites de culture 5 et 10 mi pour les cultures en masse de myélome et pour préparer des congélations de cellules.
-Plaques 24 puits pour fusion et entretien des hybridomes après fusion.
-Plaques de 96 puits pour clonage des hybridomes.
-Tubes de 50 mi stériles pour lavage des cellules et fusion.
-Lames de MALASSEZ et THOMA
PROTOCOLE DE FUSION CELLULAIRE
l* PREPARATION DES CELLULES DE MYELONE
Les cellules de myélome doivent être lavées une fois pour éliminer les protéines du sérum utilisé dans les milieux de culture.
Le lavage se fait par centrifugation à 800 rpm pendant 5 mn. Le surnageant est éliminé. Le culot est resuspendu dans du milieu sans sérum et les cellules sont à nouveau centrifugées.
Le culot est repris dans du: milieu sans sérum et les cellules sont comptées.
2* PREPARATION DES CELLULES SPLENIQUES
L'animal est tué et la rate est broyée. Les cellules sont lavées deux fois et comptées (centrifugation 1200 rpm 15 mn lavage avec du milieu sans sérum).
3* FUSION CELLULAIRE
Les deux suspensions cellulaires sont mélangées, à raison de 107 cellules de myélome pour 5.107 cellules spléniques pour une fusion, dans un tube stérile de 50mI. Les cellules sont centrifugées à 1200 rpm pendant 5 mn.
Le surnageant est éliminé et le culot est laissé à sec.
Ajouter 400 µl de PEG 1500, goutte à goutte en 1 mn.
Attendre 1 mn en agitant doucement le tube.
Ajouter 2 ml de milieu sans sérum en 2 mn.(goutte à goutte)
Ajouter 8 ml de milieu avec sérum en 2 mn (l'action du PEG est stoppée par l'addition du sérum.)
Puis 10 ml de milieu complet.(goutte à goutte).
4* CULTURE APRES FUSION
Les cellules peuvent être laissées 2 à 4 heures à l'étuve en boite de Pétri. Ensuite, les répartir en cultures indépendantes à une densité de 250.000 cellules de myélome par puits en 0.4 ml (plaque 24 puits). Ajouter 1 ml de milieu de sélection par puits. Surveiller les cultures. La plupart des cellules de myélome doivent être mortes en 2 ou 3 jours. Les clones hybrides apparaissent nettement à partir du 6ème jour.
DETECTION DES HYBRIDOMES INTERESSANTS
L'objectif est de prélever un échantillon de surnageant de culture et de doser la présence éventuelle d'anticorps.
l* PRELEVENENT DU SURNAGEANT
Cette opération doit se faire stérilement, à partir d'une culture assez dense de cellules d'hybridome (pour le TP 100 µl seront prélevés). En laboratoire 500 µl sont prélevés à la pipette Pasteur et transvasés dans un tube Eppendorf. Chaque culture prélevés doit être numérotée sans ambiguïté, ainsi que le tube qui reçoit le surnageant.500 µl de milieu complet neuf" sont remis dans chaque puits.
Après centrifugation, qui permet d'éliminer les cellules prélevées, le surnageant est transféré dans un autre tube Eppendorf. Il doit être testé rapidement ou congelé en prévision d'un test ultérieur.
2* ENTRETIEN DES CULTURES D'HYBRIDONES
Les cellules d'hybridomes, en phase de croissance exponentielle, se divisent de une à deux fois par jour. A partir d'une certaine densité cellulaire (5.l05-106/ml suivant les cultures),les
cellules ne se divisent plus et meurent très rapidement (5-12 heures de durée de plateau avant la lyse cellulaire).Il faut donc diluer régulièrement les cultures cellulaires que l'on souhaite garder, en attendant le résultat du dosage des anticorps par exemple.
Le repiquage des cellules se fait simplement par prélèvement stérile d'un aliquote de la culture et transfert dans une nouvelle boite ou plaque de culture. Il faut éviter de trop diluer les cultures cellulaires, en particulier les hybridomes nouvellement formés. En pratique, les dilutions opérées sont de 1/4 à 1/20 suivant l'état de la culture initiale (très dense, ou mortalité importante...).
3* DOSAGE DES ANTICORPS
CLONAGE D 'HYBRIDONES
Le clonage d'hybridomes se fait généralement par dilution limite. Cette technique consiste à diluer les cellules à cloner de telle manière que, statistiquement, une seule cellule soit présente dans une culture. En pratique, ce résultat est atteint si, pour 100 cultures, 37 cellules au maximum sont ensemencées (cf. la loi de Poisson).
A une telle dilution, la viabilité des cellules est souvent affectées. Pour éviter une efficacité de clonage insuffisante, les cellules d'hybridomes sont mélangées avec des cellules "feeder".
l* PREPARATION DES CELLULES "FEEDER"
En général, on prélève des thymus chez l'animal (souriceau juste sevré) et on prépare les thymocytes par simple broyage du thymus et un lavage avant resuspension en milieu avec sérum.
Les thymocytes doivent être en suspension, à forte densité (environ 107/ml) dans le milieu avec sérum. Ils seront utilisés à la concentration finale de 5.105 à 106/ml dans les puits de clonage.
2* PREPARATION DES CELLULES D'HYBRIDOMES
La suspension cellulaire est comptée soigneusement. Des dilutions successives sont faites (maximum un facteur 100) pour obtenir une suspension, en milieu avec sérum de 100 cellules par millilitre. La précision dans les dilutions est nécessaire pour la réussite du clonage: s'il y a trop de cellules, la culture obtenue ne sera pas de nature clonale (deux cellules par puits par exemple).S'il n y en a pas assez et si l'efficacité de clonage de la culture d1hybridome est faible, le nombre de clones récupérés sera faible, voire nul.
3* ENSEMENCEMENT
Le clonage se fait dans des plaques 96 puits 200 µl par puits.
3.1. Les Antigènes
Le sang des poulets B 21 / B21 et B13 / B13 est prélevé par ponction cardiaque en présence d'anticoagulant : I millilitre (ml) d'héparine pour 10 ml de sang . Las globules rouges sont rincés trois fois dans de l1eau physiologique (9 grammes de NaCl pour 1 litre d1H90) à 350 g pendant 15 minutes (mn) puis dilués dans une solution d'Alsever (volume à volume). L'Alsever permet de conserver intacts les globules rouges sans risque d'hémolyse pendant une période de 8 à 10 jours à +40C.
Calendriers d1 immunisation.
Deux types de calendriers d'immunisation des souris Balb-C ont été adoptés.
2.2.1. Calendrier d'immunisation n° I
J0 --------------------------------------------------------------------------------------------- J3
Inoculation de GR B21 à 3 mois Prélèvement de la rate de la souris
Ce protocole d'immunisation est très bref : 1 dose de 500 millions (FT) de globules rouges B21 est administrée à chaque souris âgée de 3 mois par vote intraveineuse. La rate des souris est prélevée 3 jours après l'unique injection.
ELISA :
* Faire 3 lavages avec du PBS 1 X.
* Dilution pour avoir 350.000 cellules par cupule (100 µl).
* Sécher au sèche-cheveux.
* Ajouter 100 µl de glutaraldéhyde à 25% diluée
* Après 1 heure, taire 5 à 6 lavages.
* Contact avec le surnageant 1 heure à 37°
* 3 lavages.
* 100 µl de conjugué chèvre anti souris I heure à 37°.
* 3 lavages.
* Substrat.
* Lecture après une heure.
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