ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

Dans le domaine des biotechnologies, la demande de techniques d'analyse fiables, précises et souples est de plus en plus importante. L'arrivée de l'électrophorèse capillaire sur le mar-ché offre des perspectives extrêmement intéressantes, en permettant la séparation rapide de molécules très variées, avec d'excellentes résolutions.

Les premiers travaux en électrophorèse capil-laire ont été présentés en 1974 par Virtanen (I) qui avait réalisé la détection potentiométrique de solutés séparés électrophorétiquement dans des tubes de verre de 200 à 500 pm de diamètre. Dès le départ, l'intérêt d'utiliser des tubes d'un diamètre de plus en plus en petit a été mis en évidence, ainsi que l'obligation de développer des méthodes de détec-tion qui permettent de profiter de la sélectivité de cette technique en y alliant une très bonne sensibilité.

La séparation des molécules est donc maintenant réalisée dans un capillaire composé de silice d'un dia-mètre interne de 50 nm. Dans ces conditions, la dis-sipation de la chaleur est très bonne (2) et on peut utiliser des champs électriques de plusieurs dizaines de milliers de volts sans problème de convection:

ainsi, jorgensen et Lukacks ont décrit la sépa-ration de protéines avec un nombre de plateaux théo-riques avoisinant le million par mètre, ce qui repré-sente un accroissement énorme par rapport aux tech-niques classiques de chromatographie. En dehors de l'amélioration de la sélectivité, on constate aussi une réduction conséquente des temps d'analyse.

En ce qui concerne la détection, d'importants pro-grès ont été effectués, qui ont permis l'utilisation directe du capillaire comme cellule de détection (ce qui signifie un trajet optique de 50 nm) tout en gar-dant une excellente sensibilité.

ÉLECTROPHORÊSE CAPILLAIRE EN SOLUTION LIBRE

Ce mode est certainement le plus utilisé et convient pour la séparation des molécules chargées. Dans ce cas la séparation est réalisée dans un capillaire rem-pli de tampon. Chacune de ses extrémités plonge dans un réservoir auquel on applique le potentiel; les molécules se déplacent en fonction de leur mobi-lité électrophorétique au pH choisi. Le facteur déter-minant dans ce type de séparation est l'existence du flux électro-endo-osmotique.

En effet, le capillaire, de par sa composition (silice), porte un grand nombre de charges fonction-nelles de surface négatives. Les ions positifs présents dans la solution ont donc tendance à s'accumuler à proximité de sa surface, créant une couche diffuse. Le potentiel à travers cette couche est nommé poten-tiel zêta (5).

Sous l'effet du champ électrique, ces ions positifs se déplacent uniforniément en direction de la cathode, entraînant avec eux le tampon dans lequel ils sont dissous: c'est le flux électro-endo-osmotique dont la vitesse linéaire est proportionnelle à la force du champ électrique. Le flux trouve donc son origine aux alentours de la double couche, et son profil sers plat (perpendiculaire au capillaire) Si le rayon des capillaire est sept fois plus grand que l'épaisseur 0E la double couche (G), ce qui est toujours le cas v le diamètre utilisé.

FIGURE I - PRINCIPE DE LA SÉPARATION DE MOLÉCULES CHARGÉES PAR ÉLECTROPHORÈSE EN CAPILLAIRE

Le flux electro-endo-osrnotique est provoqué par déplacement de tampon crée par l'effet du voltage sur la double couche électrique adjacente a la surface du capillaire.

VeO : vitesse du flux électro-endo-osmotique à vitesse électrophorétique propre pour la méthode considérée.

1. pH élevé séparation des molécules cherchées - par leur résistance au flux electro-endo-osrnotique.

2.pH faible séparation des molécules chargées +.

Le flux dépend aussi de la force ionique et surtot du pH du tampon, mais pas de la nature de l'échan-tillon analysé. Une force ionique faible et un pH élevé produiront un flux très rapide dans le cas des capil-laires en silice (7).

L'existence de ce phénomène a grandement faci-lité l~automatisation de la technique: le flux entrai-nant les molécules vers la cathode dans la plupart des systèmes, l'injection peut être effectuée à l'anode, tandis que le détecteur est placé à la cathode.

En résumé, Si on choisit un tampon d'un pH fai-ble, les molécules chargées positivement dans leur grande majorité migrent d'elles-mêmes vers la cathode, et leur mobilité est d'autant plus élevée qu'elles sont chargées (figure 1). Dans le cas d'une séparation effectuée à pH élevé, les molécules char-gées négativement et injectées à l'anode ne migre-raient pas en l'absence de flux. Mais en fait celui-ci suffit à assurer la migration des molécules vers la cathode. Les molécules sont alors séparées en fonc-tion de leur résistance à ce flux, résistance qui est d'autant plus forte que la molécule est chargée. Grossman et Wilson ont étudié plus particulièrement l'influence du pH et de la force ionique des tampons dans le cas de la séparation des peptides (8).

Bien d'autres facteurs sont à prendre en compte lors de l'optimisation des séparations. On observe un élargissement des bandes dans le cas où le soluté passe trop de temps dans le capillaire, ce qui peut être évité en utilisant des voltages élevés ou des capil-laires plus courts. Cependant il faut tenir compte, pour les deux facteurs, des effets de chaleur qui en résultent. Pour des capillaires d'un diamètre interne de 50 nm et d'une longueur de 1 m, le voltage maxi-mum utilisable est de 25 à 30 kV.

Enfin, comme en chromatographie, il est impor-tant d'éviter une surcharge lors de l'injection. D'après Jorgensen et Lukacks (4), les meilleurs résultats sont obtenus quand la concentration des molécules de l'échantillon est mille fois inférieure à celle du tam-pon. Dans certains cas, le fait d'injecter l'échantil-lon dans de l'eau plutôt que dans un tampon salin pro-voque un effet de stacking et contribue à la finesse des pics.

D'autre part, une diminution de la résolution, et notamment l'obtention de pics traînants, peut résul-ter d'interactions entre les molécules et la surface du capillaire, en particulier pour les cations. Latrer et MacManigill (9) ont noté une nette amélioration lors de l'ajout de sels dans le tampon. Ces sels entrent en compétition avec les sites d'adsorption. On peut aussi désactiver la surface du capillaire (3). La plupart des appareils offrent d'ailleurs la possibilité d'inverser la polarité, ce qui peut se révéler indispensable dans 16 cas où on utilise des capillaires particuliers dont la surface n'est pas chargée (le flux électro-endo-osmotique, nul, ne peut plus entraîner les molécules).

Ces traitements de surfaces doivent toutefois résis-ter aux pH élevés auxquels ce style de problèmes a tendance à survenir.

CHROMATOGRAPHlE CAPILLAIRE ELECTROCINETIQUE

Nous avons précédemment décrit un mode de séparation des molécules chargées; cependant, dans le cas des molécules neutres, il était nécessaire de trouver une technique basée sur d'autres critères en 984, Terabe et Otsuka (10) ont montré que l'usage Je micelles introduites de manière électrocinétique dans un système d'électrophorèse capillaire permet-tait la séparation des composants neutres.

Burton et Sepaniak (11) ont nommé cette techni-que chromatographie capillaire électrocinétique en présence de micelles (MECC). Il a été montré par la suite qu'elle pouvait être utilisée pour de nombreux types de molécules neutres et même chargées, cela en gardant les qualités de résolution propre à l'élec-trophorèse capillaire.

Dans ce système, l'addition de surfactants ioniques dans le tampon à une concentration submicellaire conduit à la formation d'agrégats sphériques (les micelles). Les chaînes hydrophobes du surfactant sont tournées vers l'intérieur, tandis que ses groupe-ments chargés composent la surface externe.

Les surfactants anioniques sont les plus utilisés, et en particulier le SDS. Le système est composé de deux phases, l'une aqueuse, l'autre micellienne. La surface d'une micelle de SDS a une charge négative importante, et donc une forte mobilité électrophoré-tique en direction de l'anode. Mais, aux gammes de pH utilisées pour ce type de séparation (supérieur à 6), le flux électro-endo-osmotique en direction de la cathode est plus important que la migration des micelles; en conséquence, les deux phases se dépla-cent en direction de la cathode, rapidement pour la phase aqueuse, lentement pour la phase micellienne.

La séparation des molécules est effectuée en fonc-tion de leur coefficient de partition entre les deux phases, et leur rétention croît avec leur hydrophobi-cité. La MECC se montre souvent plus efficace, même dans le cas des espèces chargées (12,13); en effet, on introduit alors, en plus de la charge, le paramè-tre supplémentaire de l'hydrophobicité. Cela a été montré, entre autres, dans le cas des catécholamines.

SÉPARATION EN FONCTION DU POIDS MOLÉCULAIRE

L'une des principales applications de l'électropho-rèse classique est la séparation des protéines en fonc-tion du poids moléculaire en SDS-PASE (Electropho-rèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS). Il était donc naturel de rechercher à appliquer cette technique en utilisant des capillaires.

Cohen et Karger (12) ont décrit la polymérisation d'acrylamide dans des capillaires de silice de 75 ttm de diamètre et de 10 à 20 cm de longueur. Ceux-ci ont été utilisés pour la séparation rapide de protéines.

L'avantage d'utiliser ce genre de supports est dou-ble : d'une part, ils permettent d'introduire un critère de séparation supplémentaire, tout en conservant les

Références:

(1) R. Virtanen (1974) Acta Polytecli. Scand. 123, 1.67.

(2).La différence de températures entre le centre et la paroi du capillaire n'est alors que de 0,05°C pour une intensité ce 11,8.10^-6 ampère.

(3) (J) I. Jorqensen & K.D. Lukacks(1981) Ana]. Chem. 53, 1298-1302.

(4)  J. Jorgensen & K.D Lukacks (1983) Science 222, 266-272

(5) A.W. Adamson (1967) Physica] Chemistry cîSudaces 2nd eci tion, Interscience, New York, 4

(6) T.S Stevens & H.J. Cortes (1983) Anal Ch eni. 55, 1365-137

(7) K.D. Lukacks & J.W. Jorgensen (1985) T Higli ResoL Chro-matogr. Commun. 8, 407-411.

(8) P.D. Grossman & K.J. Wilson (1988) Anal. Diochem. 173, 265-270.

(9) H. Lauer & D. MacManigfll (1986) Trends Anal. Chem. 5, 11-15.

(10) S. Terabe & K. Otsuka (1984) Anal. Cheni. 56,111-113.

(11) D.E. Burton & M.J. Sepaniak (1986) i Chromatogr Sci. 24, 347-351.

(12) A.S. Cohen & B.L. Karger (1987) J. Chrcmatogr 397, 409-417.

(13) R.A. Wallingford & A.G.J. Ewing (1988) i Chromatogn 60, 258-263.

(14) J.C. Giddins (1969) Sep. Sci. 4,181-189.

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