Principe d'obtention d'anticorps monoclonaux: technique des hybridomes

Prenons l'exemple d'une infection virale, la maladie de Marek qui infecte les poules; afin d'étudier le rôle des molécules de classe I  du C.M.H. (C.M.H. I) dans les interactions potentielles du virus et de la cellule-hôte, il convient de mettre en évidence un anticorps monoclonal anti-C.M.H-I. Celui-ci pourra être testé sur des cellules lymphoïdes et sanguines isolées. Pour obtenir des anticorps dirigés contre les antigènes en question, il faut immuniser des souris avec l’antigène porté par des érythrocytes de poulet (figure 1).

La culture des hybridomes en milieu non renouvelé forme une courbe avec un

optimum de croissance. C'est alors le stade le plus favorable pour conserver les cellules, à -

180°C dans l'azote liquide; elles seront ainsi dans un état physiologique se prêtant à leur

remise en culture lors de la décongélation.

Le surnagent de centrifugation (5 min 1200 rpm) renferme l'anticorps monoclonal, il

est conservé à -20°C ou à -80°C à long terme.

L’immunisation induit la sécrétion d'anticorps par les cellules lymphoïdes de type B, présentes en quantité importante au niveau de la rate.

Une fois prélevées, les cellules spléniques de la souris immunisée sont mises en culture (Cf. annexe 2); elles doivent pour cela être fusionnées à des cellules histocompatibles de myélome totipotentes, comme représenté sur la figure 1 ci-dessus. Après sélection et isolement des clones sécréteurs, on dispose de cellules productrices d'Anticorps monoclonaux.

Pour caractériser un anticorps anti-C.M.H-I (i.e. anti-classe I) obtenu par culture d’hybridomes, il faut comparer ses spécificités de marquage de différentes populations cellulaires par rapport à un anticorps anti-classe I de référence: 21.2 (cet anticorps est connu pour caractériser des antigènes de classe I).

Les mesures peuvent être effectuées grâce à un appareil automatisé, compteur de cellules et mesurant l'intensité de leur marquage par fluorimétrie: le F.A.C.S. (Fast Assay Cytometric Sorter).

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